脂类细胞化学--苏丹Ⅲ染色法实验报告

山东大学实验报告2015年3月12日姓名班级13级生命基地班学号同组者：科目细胞生物学实验实验题目脂类细胞化学--苏丹III染色法第1页共10页微生物实验报告【实验题目】脂类细胞化学--苏丹III染色法【实验目的】1.了解脂肪染色的原理、掌握脂类标本制片；2.学习用苏丹III染色法进行脂肪细胞的染色技术；3.学会用断头法处理小白鼠以及小白鼠的解剖方法。【实验材料与用品】1.试剂：苏丹Ⅲ染液、70%乙醇溶液、甲醛钙2.器具：显微镜，载玻片，盖玻片，胶头滴管，镊子，剪刀，解剖盘3.材料：小白鼠【实验原理】脂类包括的范围很广，有单纯脂、复合脂、衍生脂等。脂肪依其性质可分为中性脂肪、脂肪酸、胆固醇、鞘磷脂以及其他类脂质。脂肪是体内储存能量和供给能量的重要物质。很多细胞都含有脂肪，游离状态的脂肪呈小滴状悬浮于细胞质内，比较显著的如肝细胞。脂肪小滴可以集合，将细胞质及细胞核挤到一旁，如脂肪细胞。脂肪与类脂类和蛋白质结合时，往往不易显出，但用重铬酸钾、升汞、硝酸钴或硝酸铀氧化组织块或切片，可以显现出脂肪和类脂类。脂类不溶于水，易溶于浓乙醇、苯、氯仿和乙醚等，因此脂类标本的制作，需用不含酒精或不能溶脂的液体固定，一般常用甲醛类固定剂。脂溶性染料显示法利用苏丹染料中的苏丹III、苏丹IV、苏丹黑或者苏丹红等溶于脂类，而使脂类显色的原理显示脂类，使用时，要注意选择溶剂，要求既要溶解苏丹染料，又不溶掉脂肪。苏丹染料是偶氮染料，它对脂类的显示是一种简单的物理变化。苏丹染料也是一种脂溶性染料，易溶于乙醇但更易溶于脂肪，所以当含有脂肪的标本与苏丹染料接触时，苏丹染料即脱离乙醇而溶于该含脂肪结构中而使其显色。脂肪染料一般选用有机溶剂做溶剂，丙酮和乙醇对染料和脂肪都是很好的溶剂，这样可以染色大的脂肪积累块，但是小的脂肪滴会溶解。60%异丙醇当溶剂，可以减轻脂类的溶解。丙二醇或磷酸三乙酯不会溶解脂类物质，但是能溶解染料，是比较理想的溶剂。用这些溶剂山东大学实验报告2015年3月12日姓名班级13级生命基地班学号同组者：科目细胞生物学实验实验题目脂类细胞化学--苏丹III染色法第2页共10页微生物实验报告配的染料溶液要过滤以去掉沉淀，防止蒸发，因蒸发会引起染料在材料中积累。常用相同溶剂洗掉多余的染料，然后再用水洗，可以防止多余的染料在材料中沉淀。用锇酸固定的脂肪不溶于无水乙醇、二甲苯等类似的液体，可用于石蜡切片，但是脂肪的标本一般不用石蜡切片或火棉胶包埋，而用如下方法：冰冻切片、明胶包埋冰冻切片、铺片法。【实验步骤】一、大体流程二、具体操作1、断头法处死小白鼠，置于解剖盘中，剪开腹腔，用镊子提起小肠将盖玻片紧贴于肠系膜，并在其下部置一载玻片，用剪刀将肠系膜连同小肠一同剪下。2、滴加甲醛钙于有标本的载玻片处，使标本润湿，固定20分钟。3、吸蒸馏水滴入载玻片与盖玻片之间冲洗，用滴管不断吸去液体以去除固定液。4、用70%乙醇溶液代替蒸馏水重复步骤2的操作，再进行一次冲洗。5、用苏丹Ⅲ染色30分钟。6、吸去溢出染液，擦净盖玻片表面及周边，用显微镜观察。制作装片甲醇钙固定（20min)蒸馏水冲洗70%乙醇溶液冲洗苏丹Ⅲ染色（30min)镜检处死小鼠找肠系膜山东大学实验报告2015年3月12日姓名班级13级生命基地班学号同组者：科目细胞生物学实验实验题目脂类细胞化学--苏丹III染色法第3页共10页微生物实验报告【实验结果与分析】I.单个脂肪细胞是圆球形，内充满桔红（黄）色脂类物质。图1:10×10II.观察到的细胞染色较浅，可能是滴加染液时进入到盖玻片以下的苏丹III染液的量偏少，或者是用蒸馏水冲洗后没有用酒精冲洗干净，不利于染色。此外，观察到的细胞有些不是一层，而是多层细胞重叠在一起，可能是取肠系膜时，没有将肠系膜展平，导致肠系膜聚集在一起。图2:10×40III.细胞核呈指环状偏靠细胞膜边缘，细胞外也有散在的脂肪滴。但大部分细胞内的脂肪滴山东大学实验报告2015年3月12日姓名班级13级生命基地班学号同组者：科目细胞生物学实验实验题目脂类细胞化学--苏丹III染色法第4页共10页微生物实验报告已完全充满整个细胞，可能是观察的时间拖得过长。单个细胞的染色效果不明显，可能是染色时间不足。图3：10×40【注意事项】1.小鼠肠系膜很脆弱，易破损，因此找肠系膜时应尽量小心，以免将肠系膜扯破；2.要找有血管的肠系膜，因为血管周围一般有脂肪组织保护；3.制作装片时尽量用盖玻片撑开肠系膜，可以将小肠连同肠系膜一起剪下来；4.不要用力按压盖玻片，以免压破脂肪细胞，影响观察；5.染色时间要足够长，否则会染色不彻底，橘红色不明显；6.在染色过程中，要防止装片干燥，随时添加苏丹III染液，防止影响实验结果；7.在进行观察之前，应当用吸水纸尽可能地吸取染液后再进行观察，这样只有脂肪细胞呈橘红色，对比较明显。附：课外拓展知识一、石蜡切片制备石蜡切片的制作过程主要包括：取材固定脱水透明透蜡,封藏透明染色贴片切片包埋山东大学实验报告2015年3月12日姓名班级13级生命基地班学号同组者：科目细胞生物学实验实验题目脂类细胞化学--苏丹III染色法第5页共10页微生物实验报告1．取材材料的好坏直接影响到切片的质量,无论取哪一种动植物材料,以下几点是必须注意的.（1）植物材料选择时须尽可能不损伤植物体或所需要的部分；动物材料取用时常对动物施以麻醉,常用的麻醉剂有氯仿和乙醚,或将动物杀死后迅速取出所需要的组织.（2）取材必须新鲜,这一点对于从事细胞生物学研究尤为重要,应该尽可能割取生活着的组织块,并随即投入固定液.（3）切取材料时刀要锐利,避免因挤压细胞使其受到损伤.（4）切取的材料应该小而薄,便于固定剂迅速渗入内部.一般厚度不超过2mm,大小不超过5×5mm2.2．固定组织和细胞离开机体后,在一定时间内仍然延续着生命活动,会引起病理变化直至归于死亡.为了使标本能反映它生前的正常状态,必须尽早地用某些化学药品迅速地杀死组织和细胞,阻抑上述变化,并将结构成分转化为不溶性物质,防止某些结构的溶化和消失.这种处理就是固定.除了上述作用外,固定剂会使组织适当硬化以便于随后的处理,还会改变细胞内部的折射系数并使某些部分易于染色.固定剂的作用对象主要是蛋白质,至于其他成分如脂肪和糖,在一般制作时不加考虑,如要观察这些物质,可用特殊的方法将其固定下来。固定剂有简单固定剂和混合固定剂的划分。简单固定剂即单一的固定剂,常用的有乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞、苦味酸、铬酸、重铬酸钾和锇酸.其中,苦味酸、升汞、铬酸既能凝固细胞清蛋白,又能凝固核蛋白；乙醇只能凝固清蛋白,而醋酸只能凝固核蛋白；甲醛、饿酸和重铬酸钾对这两种蛋白质都不凝固。简单固定剂的局限性较大,如将其适当混合,制成复合固定剂可以取得更好的效果。常用的混合固定剂有：Bouin液（70份苦味酸饱和水溶液+25份4％甲醛+5份冰醋酸）、Zenker液（升汞5g＋重铬酸钾2.5g＋硫酸钠1.0g＋5ml冰醋酸＋100ml蒸镏水）、Carnoy改良液（3份无水乙醇+1份冰醋酸）等.固定剂的种类甚多,我们必须依据各种固定剂的性能及制片的不同要求来加以选择。固定时,须注意以下几点：（1）固定剂应有足够的量,一般为组织块体积的10～15倍.（2）如所固定的材料外表有不易穿透的物质,可将材料先在含乙醇的溶液中固定几分钟,再移入水溶性的固定液.（3）材料固定后如不立即下沉,可将其中气泡抽出.山东大学实验报告2015年3月12日姓名班级13级生命基地班学号同组者：科目细胞生物学实验实验题目脂类细胞化学--苏丹III染色法第6页共10页微生物实验报告（4）固定时间依材料大小、固定剂种类而异,可从1小时到几十小时,有时中间需要更新固定剂.某些固定剂对组织的硬化作用较强,作用时间应严加控制,不能过长.（5）一般固定剂都以新配制的为好,用过的不能再用.有些混合固定剂由甲、乙两液合并者,一定要在使用前才混合.（6）固定完毕,根据所用固定剂的不同,用水或乙醇冲掉残留的固定剂,以免固定剂形成沉淀,影响以后组织块的染色.3．脱水.脱水剂有两类：一类是非石蜡溶剂,如乙醇、丙酮等,脱水后必须再经过透明,才能透蜡包埋；另一类是兼石蜡溶剂,如正丁醇,脱水后即可直接透蜡。常用的脱水剂是乙醇,因为它价格便宜,易于得到。为了避免剧烈的扩散引起的组织的强烈收缩,脱水步骤应从低到高以一定的浓度梯度来进行,一般组织从30％乙醇开始,经过50％、70％、80％、95％、100％至完全脱水；对于一些柔软的组织应从15％开始.脱水时间依据组织的类型和大小而定，一般各级乙醇中放置45min到1h，如果中间须停顿，应使材料停留在70％乙醇中,因为低浓度乙醇易使组织变软、解体,高浓度乙醇有脆化组织作用,放置时间不能过长,另外,脱水必须在有盖瓶中进行,以防止高浓度乙醇吸收空气中水分导致浓度降低而使脱水不彻底.需要保存的材料可脱水至70%乙醇时停留其中,如需长期保存,可加入等量的甘油.4．透明组织块用非石蜡溶剂脱水后必须经过透明.透明剂能同时与脱水剂和石蜡混合,它取代了脱水剂后,石蜡便能顺利地渗入组织。透明剂的种类很多,较常用的是二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油和苯胺油等。5．透蜡和包埋包埋用的石蜡,熔点在50～60℃之间,应根据材料本身的硬度、切片的厚薄和当时的气温条件来选用.一般动物材料最常用的石蜡熔点为52～56℃,植物材料的用54～58℃的；切片薄的用58～60℃的,切片厚的则用52～54℃的；室温10～19℃时选用52～54℃的石蜡可顺利切片,冬季可用熔点46～48℃的石蜡,夏季可选56～58℃的.透蜡须在恒温箱中进行,恒温箱的温度调节至高于石蜡熔点3度,使经过透明的组织块依次用石蜡与二甲苯的等量混合液、纯石蜡处理.纯石蜡应处理2～3次,透蜡的时间依材料性质而定,一般每次需15～30min。包埋具体做法；先准备好纸盒，,将熔蜡倒入盒内,迅速用预温的镊子夹取组织块平放在纸盒底部,切面朝下,再轻轻提起纸盒,平放在冷水中,待表面石蜡凝固后立即将纸盒按入水中,使山东大学实验报告2015年3月12日姓名班级13级生命基地班学号同组者：科目细胞生物学实验实验题目脂类细胞化学--苏丹III染色法第7页共10页微生物实验报告其迅速冷却凝固,30min后取出。包埋用蜡的温度应略高于透蜡温度,保证组织块与周围石蜡完全融为一体.石蜡的迅速冷却也很重要,否则包埋块中将会产生结晶.以后切片时引起碎裂。6．切片在包埋以后,就可进行切片.包埋好的石蜡块装上切片机进行切片前还须进行固着和整修.切片方法：切片前,将刀口置放大镜下观察,选择刀口平整无缺刻的部分来进行切削.将所要切的包埋块固定在标本台上,使包埋块外切面与标本夹截面平行,并让包埋块稍露出一截.将刀台推至外缘后松开刀片夹的螺旋,上好刀片,使切片刀平面与组织切面间呈15°左右的夹角,包埋块上下边与刀口平行.在微动装置上调节切片要求的厚度,将刀台移至近标本台处,让刀口与组织切面稍稍接触,这时就可以开始切片了。具体操作：右手转动转轮,左手持毛笔在刀口稍下端接隹切好的片子,并托住切下的蜡带,待蜡带形成一定长度后,右手停止转动,持另一枝毛笔轻轻将蜡带挑起,平放于衬有黑纸的纸盒内,注意切片速度不宜太快,摇动转轮用力应均匀,防止切片机震动厉害引起切片厚薄不均匀,还应注意转动的方向,以防标本台后移而切不到片子.切片完毕,应及时用氯仿将切片机的有关部分擦净。7．贴片切好的切片必须贴附于载玻片上才能作进一步处理,但是切片常有细小的横纹,必须经展平后才能贴附,否则影响染色和观察.贴片一般有捞片法和烫板法.捞片法：首先将切片分割开,投入到48℃的温水浴中,这时切片都浮在水面上,由于表面张力的作用使切片自然展平,然后用涂有甘油蛋白溶液（将鸡蛋一个打破入杯中,去除蛋黄留下蛋白,用筷子充分调打成雪花状泡沫,然后用双层纱布过滤至容器中,加入等量的甘油,混合,最后加入百分之一体积的麝香草酚（thymol）作防腐用,可保存几个月到一年.）或5％明胶水溶液的载玻片倾斜着插入水面去捞取切片,使切片贴附在载玻片的合适位置,于室温下放