试述基因工程研究的原理与基本路线并举例说明其在转基因动物方面的应用

试述基因工程研究的原理与基本路线并举例说明其在转基因动物方面的应用基因工程是按照人们的愿望对携带遗传信息的分子（DNA）进行设计和改造,从而培育生物新类型或治疗遗传疾病的一种现代的、崭新的、分子水平的生物工程技术;包括基因重组、克隆、表达；其核心是构建重组体DNA的技术，因而基因工程和DNA重组技术有时成为同义词。当代人类社会所面临的人口的增加、食品的短缺、疑难病的治疗、资源的匮乏、环境染的加剧等重大问题,都在不同程度上依赖于生物技术的研究加以解决。因为生物技术能利用生物资源的可再生性,在常温常压下生产珍贵药品;节约能源和资源、减少环境污染;能创造动植物优良新品种,增加粮食生产,开辟食物新来源;解决疑难病的治疗,并能对相关的传统行业技术改造和产业结构调整产生极其深远的作用。所以生物技术蕴藏着巨大的经济潜力和社会效益。生物技术的发展,仅有20多年的历史。然而在世界范围内给医学带来了一场革命性的变化,给农业带来了新的绿色革命,使轻工、食品、环保、海洋、能源开发等有关领域得到了前所未有的发展。一、基因工程的原理现在人们常说的生物技术实际上就是现代生物技术。现代生物技术包括基因工程、蛋白质工程、细胞工程、酶工程和发酵工程等五大工程技术。其中基因工程技术是现代生物技术的核心技术。基因工程的核心技术是DNA的重组技术，也就是基因克隆技术。既然基因工程这么重要,那么什么是基因工程呢?基因工程（geneticengineering），是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是指利用DNA体外重组或PCR扩增技术从某种生物基因组中分离感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然后经过一系列切割，加工修饰，连接反应形成重组DNA分子，再将其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的过程[1]。根据这个概念，人们可以从一个生物的基因中提取有用的基因片断，植入到另外一个生物体内，从而使该生物获得某些新的遗传性状。从而获得所需要的新的生物的变种，运用基因工程可以加快生物的变异，并使生物的变异朝着有益于人类的方向发展。同时，这个定义表明，基因工程具有以下几个重要特征：首先，外源核酸分子在不同的寄主生物中进行繁殖，能够跨越天然物种屏障，把来自任何一种生物的基因放置到新的生物中，而这种生物可以与原来生物毫无亲缘关系，这种能力是基因工程的第一个重要特征。第二个特征是，一种确定的DNA小片段在新的寄主细胞中进行扩增，这样实现很少量DNA样品拷贝出大量的DNA，而且是大量没有污染任何其它DNA序列的、绝对纯净的DNA分子群体。科学家将改变人类生殖细胞DNA的技术称为“基因系治疗”（germlinetherapy），通常所说的“基因工程”则是针对改变动植物生殖细胞的。无论称谓如何，改变个体生殖细胞的DNA都将可能使其后代发生同样的改变。而且基因工程是处在分子水平上的操作，因而可以跨越不同的物种进行操作，大大改善了传统的只能同类生物杂交并且不能控制变异方向的方法。不同种的生物一般是不能交配的，例如鱼和牛，就不能进行交配而生出下一代。但是利用基因工程，我们可以把鱼的某些基因移植到牛的受精卵上，或者把牛的基因移植到鱼的受精卵上，加以培养，就可以产生既有牛的性状又有鱼的性状的新的物种。虽然基因工程有这么多的好处，但是也不是说可以滥用的。因为每种生物经过适者生存的自然选择，都能适应所处的生存环境.如果移植了外来的基因，可能会打破其体内的细胞的平衡，从而导致细胞的快速衰老甚至死亡。可见，基因工程要正确处理好细胞的相容性。二、基因工程的基本路线：一般来说，基因工程是指在基因水平上的遗传工程，它是用人为方法将所需要的某一供体生物的遗传物质--DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源遗传物质在其中“安家落户”，进行正常复制和表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。基因工程的基本操作程序[2]（如图1）：①从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或多聚酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。②在体外，将带有目的的基因的外源DNA片断连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，现成重组DNA分子。③将重组DNA分子转移到适当的受体细胞，并与之一起增殖。④从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得重组DNA分子的受体细胞克隆。⑤从这些筛选出来的受体细胞克隆中提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究实用。⑥将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能的表达，产生出人类所需要的物质。图1基因工程的一般步骤（一）、目的基因的获取1．直接从染色体DNA中分离：仅适用于原核生物基因的分离，较少采用2．人工合成：根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。3.从mRNA合成cDNA：采用一定的方法钓取特定基因的mRNA，再通过逆转录酶催化合成其互补DNA（cDNA）4．从基因文库中筛选5．利用PCR合成（二）、目的基因与载体DNA体外重组1.粘性末端连接法（如图2）：即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法采用同一种制酶进行切断，无法得到相同得粘性末端时，可采用此方法2.人工接尾法（如图3）3.人工接头连接法（如图4）图2粘性末端连接法图3人工结尾法图4人工接头连接法（三）、重组DNA分子导入受体细胞重组DNA需导入宿主细胞才能进行增殖或表达。重组质粒可通过转化（transformation）方式导入宿主细胞。如果是用λ噬菌体作为载体的重组体，则需要用外壳蛋白进行包装，使之成为具有感染能力的噬菌体，再通过转染(transfection)方式将重组噬菌体DNA导入大肠杆菌等宿主细胞。目的基因载体DNA+dGTP+dCTPPolyGPolyC3′3′3′3′（四）筛选并鉴定无性繁殖含重组分子的受体细胞（转化子）1.根据重组体的表型进行筛选：对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用插入灭活法（如图5）进行筛选。图5插入灭活法2.根据标志互补进行筛选转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。受体菌：his-在不含组氨酸的外源基因：his+培养基中生长3.根据DNA限制酶谱进行分析（如图6）图64.用核酸杂交法（如图7）进行分析鉴定采用与目的基因部分互补的DNA片段作为探针，与含有重组体的细菌菌落进行杂交，经放射自显影，如结果为阳性，即可确定重组体中带目的基因。图7核酸杂交法（五）、外源基因的表达1、原核表达体系大肠杆菌是当前采用最多的原核表达体系，尚有一些不足之处：①缺乏转录后加工机制，只能表达克隆cDNA，不宜表达真核基因组DNA，②缺乏适当的翻译后加工机制，表达真核蛋白质不能形成适当折叠或进行糖基化修饰；③很难表达大量的可溶性蛋白等。2、真核表达体系与原核表达体系比较，真核表达体系如酵母、昆虫、哺乳类动物细胞表达体系显示了较大优势性。常用于细胞转染的方法有：磷酸钙转染、DEAE葡聚糖介导转染、电穿孔法、脂质体转染及显微注射。三、基因工程在转基因动物上的应用：（一）转基因动物的概念借助基因工程技术把外源目的基因导入生殖细胞、胚胎干细胞和早期胚胎，并在受体染色体上稳定整合，使之经过各种发育途径得到能把外源目的基因传给子代的个体，即转基因动物（transgenicanimal）[3]。转入的目的基因称为转基因（transgene），这种转移目的基因的过程称为转基因作用（transgenesis）。关于“转基因”的概念，通常只限于动、植物中经基因工程技术进行的基因转移，因此品种间不论有性或无性杂交获得新基因的途径都不属此范畴。（二）转基因动物技术转基因动物技术是20世纪80年代初发展起来的一项生物技术，它克服了物种之间的生殖隔离，实现了动物物种之间遗传物质的交换和重组。根据外源基因导入的方法和对象的不同，至今主要有3种途径可以产生转基因动物，即显微注射法、反转录病毒法和胚胎干细胞法。1．受精卵原核显微注射法显微注射技术是从动物胚胎学研究移核实验的基础上发展而来。显微注射法(microinjection)是指通过显微操作仪把外源基因注入受体动物的受精卵，外源基因整合到受体细胞染色体上，发育成转基因动物的技术[4]。1974年，Jaenisch[5]应用显微注射法，在世界上首次成功地获得了SV40DNA转基因小鼠。1981年，Costantini[6]将兔β一珠蛋白基因注入小鼠的受精卵，使受精卵发育成小鼠，表达出了兔β一珠蛋白。20世纪80年代初期人们利用这一方法向动物生殖细胞转移外源基因，成功地建立了转基因小鼠。1985年转基因绵羊和转基因猪问世，以后转基因大鼠、兔、鸡、牛、鱼等都已陆续取得成功，可见显微注射法是迄今应用得较为普遍而又最有成效的一种获得转基因动物的技术。本方法是在显微镜下，用直径约为1μm的玻璃管直接插入受精卵的雄原核内，将毛细管内所带有的外源基因的DNA注入原核，然后将其移植到假孕母体输卵管或子宫内并发育成子代个体。为了解转基因的整合情况，可酌情应用斑点杂交、多聚酶链式反应或Southern印迹杂交等方法对子代个体DNA进行检测。显微注射法的优点是导入的外源基因片段可长达50kb，且无需载体，外源基因在宿主染色体上的整合率相对较高。其不足之处是外源基因的整合是随机的，因而难以控制其整合率；再者，对外源基因能否稳定整合于受体基因组的检测，必须等到子一代个体出生后经过选择才能确定，不利于在生育期长、产仔少的大家畜中应用。2．胚胎干细胞介导法胚胎干细胞（embryonicstemcell，ES）是指从哺乳动物胚胎囊胚期内的细胞团中分离出来的尚未分化的胚胎细胞，这种细胞具有发育的多能性，能够分化出各种组织[7]。20世纪80年代中期人们开始研究利用ES细胞获得转基因动物的方法。这个途径是将外源基因直接导入ES细胞，经体外培养筛选后再注入到受体囊胚腔中，与其中的囊胚细胞聚集在一起，成为受体胚胎的一部分，参与其分化。由这种胚胎发育而成嵌合体的转基因动物，即其中有一部分组织来源于整合有外源基因的供体ES细胞。在嵌合过程中，被转化的ES细胞分化而成的生殖细胞可通过杂交将引入的外源基因传递下去。在以胚胎干细胞为媒介获得转基因动物的技术中，既可以用多种方法将外源基因导入ES细胞，且细胞的鉴定、筛选比较方便，又可预先在细胞水平上测定外源基因的拷贝数、定位和表达的水平以及插入的稳定性等，而且将ES细胞注入囊胚的操作较易进行，整合率相对较高。只是建立ES细胞系本身就是一项难度极高的工作，目前小鼠ES细胞系虽已建立，但在猪、羊中还未能得到真正稳定的ES细胞株。3.反转录病毒转移基因反转录病毒感染法(retrovirus-mediatedgenetransfer)主要是利用反转录病毒DNA的长末端重复序列(LTR)区域具有转录启动子活性这一特点，将外源基因连接到LTR下部进行重组后，包装成高滴度病毒颗粒，直接感染受精卵，或微注入囊胚腔中，携带外源基因的反转录病毒DNA可以整合到宿主染色体上[8]。反转录病毒是一类含有RNA的动物病毒，它的基因组进入寄主细胞内，在反转录酶催化下合成DNA。反转录病毒的这种特性说明它有可能是一种天然的转导因子，可经人工操作改建为动物基因的转移载体。另外，反转录病毒感染效率高，但却不会招致寄主细胞的死亡，被它感染或转化的动物细胞常可持续许多世代。反转录病毒可用作载体的另一个优点是其寄主范围广泛，包括无脊椎动物和脊椎动物，其中有的还能够在人体细胞中生长。（三）转基因动物的应用转基因动物的研究内容非常广泛，20世纪80～90年代以来从基础理论到应用技术在深度和广度上都有了很大发展，并已日渐由实验室走向生产实践。1．在基因表达调控研究方面的应用利用转基因动物可作为在体内研究外源基因表达调控的“反应器”，下面仅就DNA顺式调控元件和基因在发育中的时空调节为例予以介绍。（1）顺式调控元件的研究异常的脂蛋白水平与动脉粥样