酶基础概述

酶基础概述酶工程（EnzymeEngineering）从应用目的出发研究酶，在一定的生物反应装置中利用酶的催化性质，将相应原料转化成有用的物质。是酶学和工程学相互渗透结合形成的一门新的技术科学，是酶学、微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的边缘科学。酶的组成和结构特点1．单体酶：一般有有1条多肽链组成，几乎都是水解E，Mr=13000～35000，不含四级结构，如溶解酶，胰蛋白酶等2．寡聚酶：由几个亚基通过非共价键结合，Mr=35000～数百万，具有四级结构，如磷酸化酶a和3-磷酸甘油醛脱氢酶3．多酶复合体：由几种酶嵌合而成的复合体，靠共价键连接，Mr﹥几百万。全酶=酶蛋白＋辅助因子辅因子：酶蛋白中非蛋白质部分，它可以是无机离子也可以是有机化合物。辅酶：有机辅因子与酶蛋白结合松散即为辅酶。辅基：有机辅因子与酶蛋白结合紧密即为辅基4.核酶:少数RNA具有自我拼接加工的催化活性。酶与底物的结合模型a．锁和钥匙模型：酶的天然构象是刚性的，如果底物分子结构上存在着微小的差别，就不能契入酶分子中，从而不能被酶催化。b．诱导锲合模型：当酶分子与底物接近时，酶蛋白受底物分子的诱导，其构象发生了有利于底物结合的变化，酶与底物在此基础上互补楔合，进行反应。无需完全吻合。C.中间络合物学说：底物先与酶结合成不稳定的中间络合物，再分解释放出酶与底物。影响酶的催化作用a.广义的酸碱催化：过瞬时地向反应物提供质子或从反应物中汲取质子，以稳定过度态、加速反应的一类催化反应机制b.共价催化：底物与酶以共价方式形成中间物。这种中间物可以很快转变为活化能大为降低的转变态，从而提高催化反应速度c.邻近效应及定向效应：1、指两个反应的分子，它们反应的基团需要互相靠近，才能反应。2、指酶的催化基团与底物的反应基团之间的正确向。d.变形或张力e.酶的活性中心为疏水区域酶的特点具有较高的催化效率；反应条件温和；专一性；酶的活性可调节。催化转换数：每秒钟或每分钟，每个酶分子转换底物的分子数，或每秒钟或每分钟每摩尔酶转换底物的摩尔数。酶专一性的确定确定一种底物研究影响因素：pH值、温度、底物浓度、离子强度、激活剂等确定米氏常数Km研究不同底物的作用研究光学异构体：不对称碳原子的物质酶活性的调节1.酶浓度的调节2激素调节3.共价修饰调节4.限制性蛋白水解作用与酶活力调控5.抑制剂的调节6.反馈调节7.金属离子和其他小分子化合物的调节测定酶活力时应注意几点（1）应测反应初速度：底物消耗量5％以内，或产物形成量占总产物量15％以下时的速度（2）酶的反应速度一般用单位时间内产物的增加量来表示。（3）测酶活力时应使反应温度、pH、离子强度和底物浓度等因素保持恒定。（4）测定酶反应速度时，应使[S][E]。酶活力：酶催化特定底物转化成产物的速率。单位：1kat=1mol/s=6*107IU酶单位：单位时间、单位质量酶蛋白所催化的底物反应或产物生成的物质的量（或质量）酶的转化数：摩尔催化活性，单位时间内，酶分子中每个活性中心转换的分子数目。如果每一个酶分子只有一个催化中心,那么催化中心活性等于摩尔催化活性.如果一个酶分子有几个催化中心,那么催化中心活性等于摩尔催化活性除以n.酶的比活力：每毫克蛋白质所具有的酶活力，用U/mg蛋白质表示，比活力说明酶的纯度。酶活力的测定方法：动力学法、终点法、酶偶联法、电化学法影响酶活性的因素：1、底物浓度对酶反应速度的影响：（1）米氏方程—Km：米氏常数，其数值等于酶促反应达到其最大速度Vm一半时的底物浓度。是特征常数，一般只与酶的性质、底物种类及反应条件有关，与酶的浓度无关。可近似表示表示酶与底物的亲和力假设：稳态反应条件；底物浓度非常大（2）双底物反应：序列反应（有序、随机），乒乓反应2、酶浓度对酶反应速度的影响：反应速度与酶浓度成正比——[S][E]3、pH对酶反应速度的影响：钟罩型曲线图(1)pH影响了酶分子、底物分子和ES复合物的解离状态。(2)过高、过低的pH导致酶蛋白变性。4、温度对酶反应速度的影响5、激活剂对酶反应速度的影响（1）.无机离子：一些金属离子，如Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+等。阴离子：如Cl-、Br-、I-、CN-等。氢离子。（2）.有机分子：某些还原剂如Cys、GSH等；EDTA（3）.具有蛋白质性质的大分子，如酶原可被蛋白酶激活，蛋白酶可看作为激活剂。6、抑制剂对酶的影响失活作用：指由于一些物理因素和化学试剂部分或全部破坏了酶的三维结构，即引起酶蛋白变性，导致部分或全部丧失活性。抑制作用：指在酶不变性的情况下，由于必需基团或活性中心化学性质的改变而引起的酶活性的降低或丧失。去激活作用：某些酶只有在金属离子存在下才有活性，去除金属离子也会引起这些酶活性的降低或丧失。阻遏作用：某些因素（如激素或药物等）使细胞内酶蛋白的合成减少，反应速度的降低是由于酶分子数量的减少，每分子酶的催化效力并无变化.不可逆抑制作用：抑制剂与酶的必需基团以共价键结合而引起酶活性丧失，不能用透析，超滤或凝胶过滤等物理方法去除抑制剂而使酶复活者。可逆抑制作用：抑制剂与酶以非共价键结合而引起酶活性的降低或丧失，能用物理的方法除去抑制剂而使酶复活者可逆抑制作用1、竞争性抑制作用的机理：a、抑制剂与底物在结构上有类似之处；b、可能结合在底物所结合的位点（如结合基团）上，从而阻断了底物和酶的结合；c、降低酶和底物的亲和力。（磺胺药—苯甲酸—二氢叶酸合成酶）特点：抑制剂I与底物共同竞争酶的活性位点；没有IES三元物生成；通过增大底物浓度可解除抑制剂的抑制作用。Vmax不变，Km变大。2、反竞争性抑制：抑制剂I不与游离E直接结合，只与复合物ES结合；形成三元复合物IES。Vmax变小，Km变小。3、非竞争性抑制：抑制剂I结合于E的活性部位以外的部位；可以形成S-E-I三元复合物；抑制不受[S]的影响，即增大底物浓度不能解除抑制效应。Vmax变小，Km不变。酶的活性调节与分子修饰酶的活性调节1、酶原的激活-不可逆的共价修饰：胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶2、可逆的共价调节酶：磷酸化/脱磷酸化，腺苷酰化/脱腺苷酰化，乙酰化/脱乙酰化，尿苷酰化/脱尿苷酰化，甲基化/脱甲基化，S-S/SH相互转变3、别构酶：酶分子活性中心以外的位点与各种配体（包括底物、抑制剂、激活剂等）结合后使酶分子构象发生改变，从而导致与后续配体的亲和力改变的一类酶。（大肠杆菌天冬氨酸转氨甲酰酶—CTP）4、同工酶：由两个或两个以上肽链组成，能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构、理化性质、免疫学性质不同的一组酶.(乳酸脱氢酶LDH—）。酶的化学修饰：通过各种方法使酶分子的结构发生一些改变，从而改变酶的一些特性和功能的过程目的：提高酶活力；改进酶稳定性；适应范围广；改变反应时的最佳条件；改善特异性使催化不同底物；改变催化反应类型；提高催化反应效率SkSmmax基本原理：增强酶天然构象的稳定性与耐热性；保护酶活性部位与抗抑制剂；维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶；消除酶的抗原性及稳定酶的微环境1．修饰剂的要求分子量、修饰剂链的长度对蛋白质的吸附性。修饰剂上反应基团的数目及位置。修饰剂上反应基团的活化方法与条件2、酶修饰方法：侧链基团的化学修饰、有机大分子对酶的化学修饰、蛋白质类及其他。a、金属离子置换修饰：形成金属离子-螯合物复合物：EDTA等除复合物：透析、超滤、凝胶层析将不同的金属离子与酶蛋白结合，测定酶的性质，包括活性、稳定性、抗原性，选择到适宜的金属离子修饰酶的特点：活性降低，或无活性；活性提高；稳定性增加。b、大分子结合修饰：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，改变酶的特性与功能的方法。修饰剂：右旋糖酐、聚乙二醇(PEG)、肝素、蔗糖聚合物(Ficoll)、聚氨基酸修饰酶的特点：提高酶活力、增加酶的稳定性、降低或消除抗性C、肽链有限水解修饰d、酶蛋白侧链基团修饰-NH3、-CooH、-SH、-OH、咪唑基、吲哚基、酚羟基、胍基、甲硫基。重要的修饰反应：酰化反应、烷基化反应、氧化和还原反应、芳香环取代反应氨基修饰剂：二硝基氟苯、醋酸酐、琥珀酸酐、CS2、HNO2、乙亚胺甲脂、O-甲基异脲、顺丁烯二酸酐等。巯基修饰剂：烷基化剂、酰化基、马来酰亚胺、二硫苏糖醇、巯基乙醇、硫代硫酸盐、硼氢化钠羧基修饰剂：乙醇—盐酸、水溶性的碳化二亚胺、异唑盐胍基修饰剂（二羰基化合物）：环己二酮、乙二醛、苯乙二醛酚基修饰剂:四硝基甲烷(TNM)分子内交联剂：二氨基丁烷、戊二醛、己二胺e、氨基酸置换修饰、物理修饰定点突变技术在酶分子修饰中的应用定义：指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。是蛋白质工程和酶分子组成单位置换修饰中常用的技术。应用：新的酶分子结构的设计；突变基因碱基序列的确定；突变基因的获得；新酶的获得酶蛋白化学修饰的局限性（缺点）:1.某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一性是相对的，很少有对某一氨基酸侧链绝对专一的化学修饰剂。2.化学修饰后酶的构象或多或少都有一些改变，因此这种构象的变化将妨碍对修饰结果的显示。3.酶的化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行，目前还不能用化学修饰的方法研究非极性氨基酸残基在酶结构与功能关系中的作用。4.酶化学修饰的结果对于研究酶结构与功能的关系能提供一些信息，如某一氨基酸残基被修饰后，酶活力完全丧失，说明该残基是酶活性所“必需”的，为什么是必需的，还得用X射线和其他方法来确定。因此化学修饰法研究酶结构与功能关系尚缺乏准确性和系统性。酶的发酵生产酶的生产方法1、提取法原材料：动物、植物、微生物的组织或细胞方法：细胞破碎，沉淀，离心，过滤，层析，电泳优点：对于目的酶含量丰富的材料简单方便缺点：含量低的材料杂质多，工艺路线复杂2、发酵法原材料：微生物细胞为主，植物或动物细胞相继发展方法：固体培养发酵、液体深层发酵、固定化细胞发酵和固定化原生质体发酵优点：大量，便于控制缺点：技术要求高3、化学合成法前提条件：已知酶分子的化学结构；肽合成仪缺点：纯度高，合成成本高酶生物合成法生产的主要工艺过程(1)用作培养菌种及扩大生产的发酵罐的培养基的配制(2)培养基、发酵罐以及辅助设备的消毒灭菌(3)将已培养好的有活性的纯菌株以一定量转接到发酵罐中(4)接种到发酵罐中的菌株控制在最适条件下生长并形成代谢产物(5)将产物抽提并进行精制(6)回收或处理发酵过程中产生的废物和废水优良的产酶细胞应具备的条件酶的产量高；容易培养和管理；产酶性能稳定；利于酶产品的分离纯化；安全可靠。固体培养发酵以麸皮、米糠等为主料固体或半固体的麸曲优点：设备简单，操作方便，酶浓度较高，适于各种霉菌的培养和发酵产酶。缺点：劳动强度较大，原料利用率较低，生产周期较长液体深层发酵液体培养基适用于微生物细胞，植物细胞和动物细胞的悬浮培养和发酵。机械化程度、技术管理、酶产率、质量以及产品回收率都较理想。固定化细胞发酵将细胞固定在水不溶性载体上，使之在一定的空间范围内进行生命活动(生长、繁殖和新陈代谢)。适用于胞外酶的生产优点细胞密度较高，反应器生产强度较大，可提高生产能力；发酵稳定性好，可反复使用或连续使用较长时间，易于连续化、自动化生产；细胞固定在载体上，流失较少，可在高稀释率的情况下连续发酵，提高设备利用率；发酵液中含菌体较少，利于产品分离纯化，提高产品质量。固定化原生质体发酵指除去了细胞壁的微生物细胞或植物细胞胞内酶；细胞间质中的物质；有较好稳定性，可反复或连续使用。原生质体制备较复杂，发酵培养基中需维持较高渗透压，防止细胞壁再生酶的生物合成DNA的自我复制、转录、翻译（氨基酸的活化、起始、延伸、终止）酶生物合成的调节调节控制：(1)分解代谢物阻遏作用：容易利用的碳源阻遏某些酶(主要是诱导酶)生物合成的观象。(2)酶合成的诱导作用：加进物质，使酶的合成开始或加速的过程。(3)酶合成的反馈阻遏作用。调节基因：产生阻抑蛋白（变构蛋白），与诱导物或阻遏物结合后结构改变，导致与操纵