09-第八章-微生物生态-食品微生物学-江南大学

第八章微生物生态Microbialecology•概述•第一节自然界中的微生物•第二节微生物之间的相互关系•第三节微生物与环境保护概述•生物圈地球上有生命活动的范围统称为生物圈生态学：一门研究生物系统与其环境条件间相互作用规律性的科学微生物生态学：研究微生物群体—微生物区系或正常菌群对其周围的生物和非生物环境条件相互作用关系的科学•生态学研究范围：生物圈（biosphere）、生态系统（ecosystem）、群落（community）、种群（population）。•研究意义–理论：地球进化和生物进化原因–实践：开发菌种资源、防治有害微生物、新的微生物农药、菌肥、医药、混菌发酵、生态农业，促进探矿、冶金、环保、提高土壤肥力以及开发生物能等•种群：生活在同一环境中的同种个体组成的能繁殖集团。与同种别地的种群有隔离、有界限。•群落：同一环境中两个以上种群由于生活繁殖上的连锁而构成相依赖、相制约的生物集团。生态系统•生态系统是指在一定的空间内生物的成分和非生物的成分通过物质循环和能量流动互相作用、互相依存而构成的一个生态学功能单位。•生物成分按其在生态系统中的作用，可划分为三大类群：生产者、消费者和分解者。•微生物可以在多个方面但主要作为分解者而在生态系统中起重要作用。微生物在生态系统中的作用•是有机物的主要分解者•是物质循环中的重要成员•是生态系统中的初级生产者•是物质和能量的贮存者•是地球生物演化中的先锋种类微生物与生物地球化学循环•碳循环•氮循环•硫循环•磷循环•铁循环•其它元素的循环•生物地球化学循环(biogeochemicalcycles)是指生物圈中的各种化学元素，经生物化学作用在生物圈中的转化和运动。这种循环是地球化学循环的重要组成部分。碳在生物圈中的总体循环氮循环•氮循环由6种氮化合物的转化反应所组成，包括：固氮作用氨化(脱氨)作用硝化作用硝酸盐还原与反硝化作用第一节微生物在自然界中的分布与菌种资源本节内容：一、微生物在自然界的分布二、菌种资源的开发微生物在自然界的分布•生物体内外的正常菌群–人体微生态–无菌动物与悉生生物–植物微生态•土壤中的微生物•水中的微生物•空气中的微生物•腐败食品中的微生物•极端环境中的微生物一、生物体内外的正常菌群•人体的正常微生物区系–正常菌群：生活在健康动物各部位，数量大、种类较稳定且一般是有益无害的微生物，称为正常菌群。–正常菌群与人体的关系：一般能维持平衡，菌群内部的各种微生物之间，也是相互制约而维持相对稳定•微生态关系正常菌群之间、正常菌群与宿主之间，正常菌群与环境因子之间的关系人体的正常微生物区系•有大量微生物的存在部位–皮肤–粘膜–口腔–鼻腔–一切与外界环境相通的腔道：胃肠道、生殖道1014，人体细胞总数的10倍人体上的微生物其它生物体•无菌动物（germ-freeanimal）：体内外检查不到任何正常菌群的动物•悉生生物（gnotobiotics）：已经人为接种某已知纯种微生物的无菌动物•根际微生物（rhizospheremicroorganism）：植物根系经常向周围土壤分泌各种外渗物质，故根际有大量微生物活动。种类组成受植物的种类和植物发育阶段影响。•附生微生物（epibioticmicrobe）：指生活在植物体表面，主要借其外渗物质或分泌物质为营养的微生物。叶面微生物是主要的附生微生物。二、土壤中的微生物•土壤是微生物的合适生境•土壤中的环境条件：营养、水分、空气、酸碱度、渗透压和温度条件都适于微生物的生活，土壤微生物种类齐全、数量多、代谢潜力巨大，是微生物的大本营、也是人类最丰富的“菌种资源库”•土壤微生物的数量和分布主要受到营养物、含水量、氧、温度、pH等因子的影响，集中分布于土壤表层和土壤颗粒表面。典型花园土壤不同深度每克土壤的微生物菌落数/CFu深度/cm细菌放线菌*真菌藻类3-8975000020800001190002500020-25217900024500050000500035-40570000490001400050065-751100050006000100135-1451400——3000——土壤中的微生物类群•土壤是自然界微生物活动的主要场所，1g表层土壤中含微生物的数量可达107~108个。•水分、营养、pH、渗透压、氧、温度•土壤中微生物的分布和数量分布和数量108~109个/克肥沃土，106~107个/克贫瘠土细菌放线菌霉菌酵母菌藻类原生动物–~108~107~106~105~104~103个/g影响因素有机物含量、湿度、pH、土壤类型、深度、季节、施肥土壤中微生物的主要类群细菌：主要异养菌,在潮湿土壤中生长,pH近中性放线菌：异养型,pH6.5-8.0种类数量丰富,干旱土中较多真菌：异养型霉菌：严格好氧类群酵母菌：几～几千个/克，含糖丰富土壤中较多（105个/g）藻类：光能自养型土壤中微生物的含量•土壤中微生物的含量与土壤有机质含量有直接关系。–表层耕作土中含量最高，耕作层厚度20~30cm，地表土受阳光直接照射，其中微生物含量较低。–采取土样时一般要刮开表土2~3cm后采样。•土壤微生物的作用改变土壤的性质；进行物质转化；提高土壤肥力菌种筛选和分离的步骤•调查研究及查阅充分的资料–确定采集样品的生态环境•设计实验方案–确定特定的增殖条件•采样–确定特殊的选择培养基及可能的定性或半定量检测法•增殖培养•平板分离–纯化菌种•性能测定一.采样•采样：采集含菌的样品。•采集目标：–由于在土壤中几乎可找到任何微生物，所以土壤一般是首选的采集目标。–除土壤以外，其他各类对象上都有相应的占优势生长的微生物。•采样中应考虑环境条件对土样本中微生物分布的影响。1.环境条件对微生物分布影响•土壤中有机物的含量（营养环境）•水分•温度•通风•酸碱度•植被情况（1）土壤中营养环境•高糖环境（加工蜜饯、糖果、蜂蜜的环境）土壤–耐渗透压酵母，柠檬酸产生菌，氨基酸产生菌•富含淀粉环境污泥、水沟旁土壤中–淀粉酶产生菌•森林中腐叶烂草下土壤–纤维素酶产生菌•富含蛋白质（蚕丝、豆饼、生皮晒厂）土壤–蛋白酶产生菌•油田土–石油分解菌(2)环境条件对分布的影响•水分–①离地表5-15cm土样–②含水过多、过少都不理想•温度：采样以秋季为好•通风•酸碱度：–细菌、放线菌：中性或偏碱；–霉菌、酵母：偏酸•植被情况–植被的种类对微生物的分布有密切的关系。采样方法•采样方法–（1）去除表层土–（2）取5-15cm土样几十克–（3）装入无菌牛皮低袋或塑料袋中–注意•（1）记录：时间，地点，环境情况等•（2）样品袋应封好口，防止水分失去•（3）土样应在分离前破碎•（4）尽快分离二.增殖培养（富集培养）•适用对象：样品中目的菌所占比例较低•目的：增加样品中目的菌的数量，增大分离几率•原理：通过控制营养成分或培养条件，使目的菌得以繁殖，而非目的菌的生长受到抑制。–选择性培养基，如在土样中加入纤维素，富集纤维素分解菌增殖培养的方法•控制培养基的营养成分•控制培养基的pH•控制培养的温度•热处理：增殖芽孢细菌–样品悬浮液经80℃、10分钟处理，杀死营养体，再添加营养培养，可增殖产芽孢细菌•添加抑制剂三.纯种分离•目的：将目的菌从混杂的群体中分离出来，获得纯培养。•纯种分离的一般方法：–稀释平板法：倾注平板或涂布平板–划线分离法–组织培养法：适用于分离高等真菌和植物病原菌–稀释摇管法：适用于分离严格厌氧菌稀释分离划线分离厌氧菌的培养法•去除培养基中的溶解氧，降低Eh值–煮沸法–培养基预还原法•创造无氧的环境–物理学方法–化学方法：试管无氧培养法P392–生物学方法–混合法：厌氧罐法；厌氧手套箱厌氧菌的斜面培养法厌氧培养装置Hungate滚管技术的厌氧试管三种厌氧培养皿厌氧罐及厌氧手套箱四.筛选•目的：进行生产性能测定，确定适合要求的菌株。•过程–平皿反应快速检出法–粗筛和复筛两步•培养条件优化–培养基的组成、通风量、pH值、培养温度、培养时间等–分析：定量分析平皿反应快速检出法•1.纸片培养显色法•2.透明圈法–碳酸钙平板透明圈：产酸量–酪蛋白平板透明圈：蛋白酶•3.变色圈法–淀粉平板喷稀碘液：透明圈，液化型淀粉酶–支链淀粉平板喷稀碘液：蓝色圈，异淀粉酶–支链淀粉平板喷稀碘液：无色圈，液化型淀粉酶–加葡聚糖的刚果红平板：葡聚糖酶平皿反应快速检出法•4.生长圈法–适用：氨基酸，核苷酸，维生素产生菌的选育–工具菌：•营养缺陷型，不能合成的物质为目的菌积累的产物•菌落形态明显不同于目的菌•5.抑菌圈法–适用：抗生素产生菌的选育–工具菌：对目的抗生素敏感的微生物初筛和复筛的比较初筛复筛种子斜面菌种液体种子摇瓶每株1瓶每株3~5瓶接种量每瓶一环3~5%取舍情况留下产量较高的10~20%的菌株每次保留10~20%，直至最后3~5株好氧培养•五.纯种分离及筛选–单细胞（单孢子）分离：获得细胞纯–小滴分离法、显微操纵器进行分离•六.生产性能试验–培养条件优化，最终菌株可作为生产菌株或进一步育种出发菌株•七.毒性试验及菌种鉴定从自然界中分离菌种•举例设计一种从自然界分离中温型（高温型）淀粉酶高产菌株的方案，并说明主要步骤的基本原理–从粮食加工厂、饭店附近土壤、阴沟（高温堆肥）采样→用含淀粉的液体培养基于37℃（50~60℃）增殖→淀粉平板划线或涂布→依透明圈大小挑选菌株→划线纯化→液体摇瓶发酵→筛菌株（初筛、复筛）→测酶活→鉴定菌株→获高产菌株水中的微生物类群•水中微生物的来源土著微生物，来自空气、土壤、污水、垃圾中的微生物水包括大气水（雨雪）、地面水、聚集水（河流、湖泊、水库）、地下水、海水•这类微生物类群，会由于阳光的照射、河水的流动以及遇到不利的条件，如水中有机物因消耗而减少，浮游生物及噬菌体的吞噬，迅速死亡。水生生境的微生物•水生生境主要包括湖泊、池塘、溪流、河流、港湾和海洋。•水体中微生物的数量和分布主要受到营养物水平、温度、光照、溶解氧、盐分等因素的影响。水体微生物的分类•清水型水生微生物–指能生长在含有机物不丰富的清水中的化能自养型或光能自养型的微生物。如硫细菌、铁细菌、衣细菌，蓝细菌、绿硫细菌、紫细菌等。–仅从水域中吸取无机物或少量有机物作营养–发育量一般不大•腐生型水生微生物–指能利用进入水体的废物废水为作为营养的微生物。如变形杆菌、大肠杆菌、产气杆菌、产碱杆菌以及芽孢杆菌、弧菌和螺菌等。–能利用腐败的有机残体、动物和人类排泄物，生活污水和工业有机废物废水–发育量大不同水体中的微生物种类水淡水海水地下水：无色杆菌、黄杆菌、革兰氏阳性杆菌、微球菌、诺卡氏菌地表水溪水：营养少、主要是革兰氏阴性无芽孢杆菌、生丝微菌河水：出现假单孢菌、芽孢、肠杆菌、弧菌、螺菌、硫细菌、微球菌、八叠球菌、诺卡氏菌、链球菌、螺旋体等污水生活污水：荧光、绿脓、变形、枯草、阴沟、大肠、粪链球菌、病毒和噬菌体生产污水：与所含污物有关：密度大、渗透压高、冰点低。多数为革兰氏阴性菌、多嗜盐、河口处有耐盐菌，常见菌种：假单孢菌、弧菌、螺菌、无色杆菌、黄杆菌水体的自净作用（SelfCleaning）•水体的自净作用通过稀释、沉降、吸附等物理作用，以及生物学和生物化学的作用，包括好氧菌对有机物的降解、原生动物对细菌的吞噬、噬菌体对宿主的裂解、藻类对无机元素的吸收利用、浮游动物和后生动物通过食物链对有机物的摄取和浓缩作用，水体对有机或无机污染物的自净作用•水体自净作用的实质除去水中天然微生物类群，其余微生物一般只生存一段时间，很快便死亡•饮用水的微生物指标–细菌总数(CFU)≤100个/ml–大肠菌群≤3个/L•由水传播的疾病及其检验依据–痢疾、霍乱、伤寒、肠道传染病–检验：直接检验法、大肠菌群法大肠菌群•肠道正常细菌有三类：大肠菌群、肠杆菌和产气荚膜杆菌大肠菌群：一群以大肠杆菌为主的需氧及兼性厌氧的G-无芽孢杆菌，能在48h内发酵乳糖产酸产气。（大肠埃希氏菌、柠檬酸细菌、产气气杆菌、肠杆菌、克雷伯氏菌等）肠道致病菌上：痢疾杆菌右：霍乱弧菌右上：伤寒沙门氏菌四、空气中的微生物类群•空气不是微生物