蒸发光散射检测器

蒸发光散射检测器(ELSD)在药物分析中的应用中国药品生物制品检定所[e-mail]概述•HPLC-ELSD测定抗生素含量的方法将被收入2005版中国药典•ELSD可以对所有挥发性低于流动相的物质作出准确检测，而与被检测物质的化学基团关系不大，物理性质类似的物质响应一致，响应值与样品的质量成正比。•ELSD作为一种新型检测器，其理论知识和实践应用仍在不断发展中。背景•检测器的作用是将色谱柱流出物中样品含量的变化转换为可供观测的信号，通常是转换为电信号，以便自动记录下来进行定性定量分析。•传统检测器分为：通用型检测器和选择性检测器。•针对传统检测器的局限性，近年来，质谱（MS）和蒸发光散射检测技术（ELSD）被列入高效液相色谱检测技术行列。主要内容•1蒸发光散射检测技术•2响应特性•3实验条件选择与优化•4定量计算•5应用实例第一部分蒸发光散射检测技术•蒸发光检测器工作原理•蒸发光检测器构造与操作模式•蒸发光检测器基本特点•蒸发光检测器的应用优势1.1蒸发光散射检测器工作原理•检测三步曲雾化蒸发检测检测三步曲示意图1.2ELSD构造与操作模式A型－所有液滴进入漂移管及流动池(又称“无气溶胶分流NoAerosolSplitting”)B型－部分液滴分流排掉；只有一部分进入漂移管及流动池(“气溶胶分流AerosolSplitting”)A型蒸发光散射检测器示意图B型蒸发光散射检测器示意图两种操作模式的应用区别•A型操作模式通常使用比较高的操作温度，较适合于高有机含量和低流速流动相。A型仪器通常灵敏度更高一些。•B型操作模式在较低的操作温度下效果较好。在使用高含水、高流速流动相时，B型ELSD通过分流可以得到相对稳定的基线。•在实际应用中采用何种模式ELSD，取决于样品的性质和实验目的。1.3ELSD的基本特点蒸发光散射检测器的检测结果是一个受多因素影响的综合结果。仪器设计、化合物性质、实验条件的选择（载气流速、漂移管温度、流动相组成…..）•灵敏度•检测限与定量限•稳定性与重现性•线性1.3ELSD的基本特点1.3.1灵敏度•灵敏度是指测量响应除以对应的输入量变化•灵敏度实际上就是响应值-浓度（或样品量）关系作出的直线的斜率。•斜率越大则灵敏度越高。样品量响应值SELSD响应曲线1.3.2检测限与定量限•检测限：取信噪比为3，即以噪声的3倍作为最小可检测的信号。•定量限：取信噪比为10，即以噪声的10倍作为最小可准确定量的信号。•某种化合物在ELSD中的检测限并不固定不变，它可能随着实验条件的改变而变化，通常在10～几百ng。ELSD响应曲线1.3.3稳定性与重现性•在常规实验中，以进样精密度反映出来的ELSD稳定性，通常RSD2%。•ELSD重现性通过随行标准曲线能够有效保证。•ELSD可以满足一般定量要求。•线性范围是指灵敏度保持不变时样品的最大用量与最小用量之比。反映在检测器响应曲线上就是保持直线线段的样品量变化范围，即检测器输出信号与样品呈线性关系。1.3.4线性1.3.4线性•所有的液相色谱检测器都有一定的线性范围，用方程表示为：•当x=1时，为线性响应，但对常用的检测器来说，仅在某一范围内接近于1，实际只要在0.98～1.02范围内，即可认为是线性。xBCAELSD线性特征•线性不过零点•线性范围较窄•低浓度非线性1.3.5ELSD与其它HPLC检测器的比较1.4ELSD的应用优势•对无特征紫外吸收或只有紫外末端吸收的大分子有机化合物的检测，显示出极大的优越性。•简化了样品的预处理过程，缩短了分析时间。•基线稳定，样品检测灵敏度高。流动相的蒸发使得ELSD和梯度洗脱相容，可以提高色谱分离的分辨率并缩短分析时间。•只需一个标准品就可定量两个或更多的未知品，因此可以通过和内标比较来定量未知化合物。此特性对于组合化学中用组合技术合成的化合物的定量尤其有用。•所选的未知物结构相似而分子量不同，定量准确性更高。1.4ELSD的应用优势•UVD：定量未知化合物是很困难的，样品的紫外吸收值往往和代表样品质量的色谱峰大小无关。•ELSD：其响应不依赖于样品的光学特性，代表了样品的组成，检测信号更为直接的代表样品的真实浓度，与样品的质量浓度呈正比，因而能用于测定样品的纯度或检测未知物。1.4ELSD的应用优势•ELSD的一些性能指标虽然还不能与某些更成熟HPLC检测器相比，但ELSD的检测原理在某些方面有其独到之处。•认真分析ELSD的有关特点，合理运用，将不利因素的影响降低到最低程度，提高准确度、精密度和重现性。1.4ELSD的应用优势第二部分ELSD的响应特性•响应特性是指在确定条件下，输入值与对应响应之间的关系。通用性响应因子的一致性ELSD的剂量响应关系曲线2.1通用性•蒸发光散射的响应值与被测物质的官能团和光学性质无关，故可用于对各种物质的检测。•散射光的响应值与粒子质量的关系：I＝kmb•取对数：lgI＝blgm＋lgkm：待测组分的粒子质量和I：待测组分所产生的散射光光强k,b：常数2.1通用性•验证：分别精密称取基准氯化钠、麦迪霉素、雷帕霉素、头孢硫眯、妥布霉素适量，溶解并稀释至不同的浓度后，采用离柱分析，进样后，记录其色谱行为，以峰面积对样品量作出各种物质在ELSD中的响应曲线。2.1通用性－响应值与物质结构0.E+005.E+061.E+072.E+072.E+073.E+0705101520253035物质的进样量（ug）峰面积（mv）MidecamycinRapamycinCefo妥布霉素NaCl2.1通用性－响应值与物质结构2.1通用性－响应值与物质结构样品麦迪霉素雷帕霉素头孢硫脒妥布霉素RSD斜率12112941470076135658112352809.06%不同物质的量值响应曲线的斜率与物质的本身结构有关。通用性－物质结构对响应值的贡献•头孢羟氨苄•头孢氨苄•阿莫西林（羟氨苄西林）•氨苄西林以经称量和含量校正后的峰面积作为响应因子。•R=H，为头孢氨苄；R=OH，为头孢羟氨苄通用性－物质结构对响应值的贡献•R=H，为氨苄西林；R=OH，为阿莫西林通用性－物质结构对响应值的贡献NHH2NOHRNSOHCH3CH3OOHHH通用性－物质结构对响应值的贡献名称头孢羟氨苄头孢氨苄阿莫西林氨苄西林峰面积450901435247386093362936含量95.0%93.2%86.2%85.6%响应因子474633467004447903423991分子量363347365349通用性－物质结构对响应值的贡献头孢类带羟基青霉素类不带羟基平均羟基引入1.63%5.64%3.6%N，S杂环扩环5.97%10.14%8.1%•羟基引入，分子极性增强，ELSD响应值增加；分子极性对ELSD影响较大。通用性－物质结构对响应值的贡献NSNHH2NOOOOHCH3HHH头孢拉定通用性－物质结构对响应值的贡献通用性－物质结构对响应值的贡献NSNHH2NOOOOHCH3HHH头孢氨苄通用性－物质结构对响应值的贡献NSNHH2NOOOOHHHHCl头孢克洛通用性－物质结构对响应值的贡献头孢拉定头孢氨苄头孢克洛响应因子580563622129583651变化量1+7.2%（1）+0.5%（-6.6%）Ceftezole,R=Hcefazolin,R=CH3通用性－物质结构对响应值的贡献通用性－物质结构对响应值的贡献头孢替唑头孢唑林响应因子530865533632变化量1+0.5%•西林中的五元N、S杂环变为头孢中的六元环，引起ELSD响应值大幅度增加。其原因可能涉及原子排布变化，引起分子极性分布和分子体积变化有关，这些因素也可能影响分子的聚集和所形成颗粒的大小。通用性－物质结构对响应值的贡献2.1通用性•不同类别的化合物在ELSD中均有良好的响应，证实了ELSD的通用性•不同化合物在ELSD中响应值不同，说明ELSD响应值与化合物本身的结构（或物理性质）有关。2.2响应因子一致性•不同的物质在蒸发光散射检测器中几乎具有相同的响应因子，这种响应因子的一致性，使纯度分析结果和多组分物质的相对比例测定结果更准确。•在无合适对照品的情况下，采用另外一种含量已知的物质作内标，测定未知物含量成为可能。•氨基糖甙类抗生素•大环内酯类抗生素•四环类抗生素•喹诺酮类抗生素•β-内酰胺类抗生素2.2响应因子一致性响应因子一致性－大环内酯类•十六元环大环内酯类抗生素麦迪霉素（麦迪霉素A1）麦白霉素吉他霉素响应因子一致性－大环内酯类离柱分析麦迪霉素类抗生素的响应因子y=388557.7508x-1050250.8000R2=0.9975y=399283.5525x-1066870.3000R2=0.9965y=386285.3626x-1068210.7000R2=0.99790.E+001.E+062.E+063.E+064.E+065.E+066.E+067.E+068.E+069.E+061.E+07051015202530物质的质量（ug）峰面积（mv）麦迪霉素麦白霉素吉他霉素响应因子一致性－大环内酯类麦迪霉素麦白霉素吉他霉素RSD斜率3885583992843862851.77%截距1050251106687010682110.94%•盐酸四环素•土霉素•盐酸美他环素响应因子一致性－四环类抗生素OHOOHOONH2OHNHHR2HR1OHCH3CH3•四环素R1=CH3OHR2=H•土霉素R1=CH3OHR2=OH•美他环素R1=CH2R2=OH响应因子一致性－四环类抗生素响应因子一致性－四环类抗生素盐酸四环素盐酸美他环素土霉素RSD斜率100189197469810018981.58%•阿米卡星（丁胺卡那霉素）•西索米星•奈替米星•依替米星•威替米星响应因子一致性－氨基糖苷类OHOOOOHOOHCH3CH3NHNH2CHNH2NH213NHR1R2名称R1R2双键*西索米星HH奈替米星-C2H5H+威替米星-C2H5-CH3+依替米星-C2H5H－HONH2NHOOONH2OCH2OHOHNH2HOOOHHOHOCH2NH2HOH阿米卡星响应因子一致性－氨基糖苷类1硫酸盐2阿米卡星3西索米星4奈替米星5依替米星6威替米星响应因子一致性－氨基糖苷类阿米卡星校对曲线y=1.461x+5.0667R2=0.99954.855.25.45.65.86-0.200.20.40.60.8进样量（微克）的常用对数峰响应值的常用对数依替米星校对曲线y=1.4611x+4.8528R2=0.99994.855.25.45.65.8600.20.40.60.8进样量（微克）的常用对数峰响应值的常用对数校正线性方程：•Amikacin：y=1.46x+5.07，r=0.9997•Sisomicin：y=1.51x+5.03，r=0.9997•Netilmicin：y=1.52x+4.88，r=1.0000•Etimicin：y=1.46x+4.85，r=0.9999•Vertilmicin：y=1.41x+4.90，r=0.9998•斜率的RSD＝2.92%响应因子一致性－氨基糖苷类响应因子一致性－氨基糖苷类误差来源f∑(x-x)2∑(x-x)(y-y)∑(y-y)2b离差分析f平方和均方F值P奈替米星50.2340.3550.5401.51740.001430.0003585.250.05威替米星50.2370.3300.4671.39040.007510.00188二组误差和80.008940.00112公共坡度100.4710.6851.0071.45490.01080.0012平行性10.001860.001861.660.05•依诺沙星（Enoxacin）•左氧氟沙星（Levofloxacin）•环丙沙星（Ciprofloxacin）•洛美沙星（Lomefloxacin）•加替沙星（Gatifloxacin）响应因子一致性－喹诺酮类依诺沙星左氧氟沙星响应因