基因工程的常规技术1

第三章基因工程常规技术（P32—52）•电泳技术•杂交技术•转化技术•PCR扩增技术•文库构建技术•测序技术第一节凝胶电泳技术Electrophoresis电泳（electrophoresis)•带电物质在电场中向相反电极移动的现象核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段；一、琼脂糖凝胶电泳•用琼脂糖凝胶作为支持介质的区带电泳法。琼脂糖是一种线性多糖聚合物，是从红色海藻中提取而来。在高温水溶液下会溶解，常温下凝固并形成一定大小孔径的惰性介质，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。1、原理DNA分子的磷酸基团在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下DNA分子向正极泳动琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用琼脂糖的分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。注意事项：EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。2、琼脂糖凝胶电泳的影响因素•1）样品DNA分子大小和分子构型•2）琼脂糖浓度p33取决于所分离DNA片段的大小•3）缓冲液TAE、TBE•4）电泳条件电压：3-5V/cm时间：30-60min常用的电泳缓冲液•二、聚丙烯酰胺凝胶电泳以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，其分辨率高于琼脂糖凝胶电泳，用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。分离小片段DNA(1—1000bp)效果较好,其分辩力极高。聚丙烯酰胺由丙烯酰胺单体和甲叉双丙烯酰胺聚合而成。三、脉冲电场凝胶电泳（PFGE）（Pulse-fieldgelelectrophoresis）•PFGE是交替变换电场方向的电泳，以一定的角度一定的时间变换电场方向。•DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间取决于它的大小。分子越大，改变构象的时间就越长，重新定向的时间就越长，移动也就慢，反之越快。•可区分长度为50-100Kb以上，甚至Mb级别的大片段DNA分子。第二节分子杂交技术•杂交的基本原理•探针及探针标记•杂交的基本方法一、基本原理•变性与复性杂交技术：是利用DNA分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性，对某一特异性DNA序列进行探查的技术。二、探针与探针标记探针（probe）：用作检测的被标记的短片段特异DNA或RNA序列。（一）探针的种类–基因组DNA探针、cDNA探针、寡核苷酸探针、RNA探针（二）标记物–同位素标记：32P、35S、3H等–非同位素标记：地高辛、生物素、荧光素等切口平移法随机引物法KlenowDNA聚合酶3’末端补平反应T4多核苷酸激酶5‘末端引入标记磷酸基团末端转移酶3‘末端连接标记的核苷酸（三）探针标记方法1、均匀标记2、末端标记法DnaseⅠ使DNA双链产生缺口DNA聚合酶将生物素标记的dNTP插入到缺口的3`端1）切口平移标记法2）随机引物法（randompriming）以6~8个核苷酸长的序列随机的寡核苷酸作为引物，在Klenow片段作用下，加入带有标记的dNTP进行随机扩增，即可形成放射性同位素标记的DNA探针。优点：由于随机引物标记仅仅需要一种酶，比较简单，条件易于控制，杂交重复性好，所以应用较多。末端标记用KlenowDNA聚合酶对DNA的3‘末端进行标记用T4多核苷酸激酶标记DNA5ˊ末端p-CGA……CG-OH碱性磷酸酶(AKP）OH-CGA……CG-OH[γ-32P]ATPT4噬菌体多核苷酸激酶（PNK）32P-CGA…….CG-OH三、分子杂交的基本方法•Southern杂交•Northern杂交•Western杂交•菌落（噬菌斑）原位杂交•斑点杂交（一）Southern杂交•1975年，英国EdwenSouthern创建•检测DNA杂交方法，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。•Southern杂交主要用来判断某一生物样品中是否存在某一基因，以及该基因所在的限制性酶切片段的大小。关键技术•1、Southern印迹转移：核酸样品在凝胶上进行分离后，通过影印的方式转移到固相支持物滤膜上的过程。•2、分子杂交：将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记的DNA/RNA探针进行杂交。因此，核酸杂交也被称为“DNA印迹杂交”。1、Southern印迹转移•可以通过毛细管虹吸法或电转移或真空转移的方式，将凝胶上的DNA转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上。最后通过80℃处理或紫外线照射将DNA固定在滤膜上。吸水纸毛细管虹吸法Southern转膜2、分子杂交•预杂交将结合了DNA分子的滤膜先与特定的预杂液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精DNA或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附。•杂交在一定的溶液条件和温度下，将标记的核酸探针与滤膜混合，如果滤膜上的DNA分子存在与探针同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链，从而吸附在滤膜上。•洗膜经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去。1.待测DNA样品的制备、酶切2.待测DNA样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳3.凝胶中DNA的变性：碱变性4.Southern转膜(印迹)：毛细管虹吸印迹法、电转移法、真空转移法5.Southern杂交(预杂交、杂交、洗膜)6.杂交结果的检测：放射性自显影/生化检测Southern杂交流程总结（a）（b）（c）（d）（e）基因组DNADNA限制片段硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的基因DNA片段X光底片SouthernblottingSouthernblot的结果SouthernDNA印迹杂交之X光显像图片水稻（OryzasativaL.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶BglⅡ(A-C)、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加样在含有EtBr染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32P标记的玉米psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带，表明含有水稻的psbA基因序列。ABCDEFGHIJKL（二）Northern杂交•检测特定RNA（主要是mRNA）分子的方法•与Southern杂交的不同–靶核酸：RNA–RNA电泳:变性凝胶电泳•应用：检测在转录水平某基因是否表达（三）Western杂交•蛋白杂交/蛋白质的免疫印迹•检测蛋白质，即将电泳分离的蛋白质转移到固相载体上，通过抗体以免疫反应形式检测滤膜上是否存在被抗体识别的蛋白质，并判断其分子量。所用的探针不是DNA或RNA，而是针对某一蛋白质制备的特异性抗体。主要步骤–蛋白质样品的制备–SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳–蛋白质的电转移–靶蛋白的免疫学检测•靶蛋白于第一抗体（一抗）反应•与标记的第二抗体（酶标二抗）反应•显色反应：酶促反应Western杂交主要用来检测细胞或组织样品中是否存在能被某抗体识别的蛋白质，从而判断在翻译水平上某基因表达与否、表达量、分子量。酶标记的第二抗体第一抗体膜上结合的蛋白成分第一抗体膜上结合的蛋白成分（四）菌落（或噬菌斑）原位杂交colonysituhybridization•直接以菌落或噬菌斑为对象来检测重组子的技术。•因为生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑，是按照原来的位置不变的转移到滤膜上，并在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用，故也称为原位杂交。（五）斑点杂交•斑点杂交是分子杂交中最简单的一种，直接将DNA或RNA分子以斑点的形式固定在滤膜上，然后进行分子杂交。•当核酸分子的斑点面积变得更小，在单位面积滤膜上处理的样品数量就更多，当检测的灵敏度进一步提高后，就发展成DNA芯片。