基因工程概论

基因工程华中师范大学陈明清参考书：•基因工程原理，吴乃虎编著，科学出版社•基因工程，彭银祥，李勃，陈红星，华中科技大学出版社。•基因工程概论，张惠展编著，华东理工大学出版社。•基因工程原理，徐晋麟，陈淳，徐沁主编，科学出版社。•分子克隆实验指南，J.Sambtook,EFFrish,TManiatis,金冬雁，黎孟枫等译，科学出版社。•基因工程，楼士林等编著，科学出版社《基因工程》第一章导论第二章基因操作的工具酶第三章基因克隆的载体第四章基因克隆的策略第五章克隆基因的表达第六章基因工程的基本技术第一章导论第一节基因工程的诞生第二节基因工程的研究内容第三节基因工程的成就和前景展望细胞的发现1859年《物种起源》进化论的提出MendelG.J.(1822-1884).1856-1864豌豆杂交实验。Mendel和遗传规律的研究1900年Mendel遗传规律被重新发现遗传学的元年1866年发表论文，提出分离规律和独立分配规律1909年YohannsenW.L.(1859-1927)发表了“纯系学说”首先提出了“基因”的概念，代替了Mendel“遗传因子”的概念。基因概念的提出1910年以后，MorganT.H.等提出了基因的连锁遗传规律，染色体遗传理论发展为《细胞遗传学》连锁遗传规律的提出1941年，BeadleG.W.等证明了基因通过酶起作用，提出了“一个基因一个酶”的假说一个基因一个酶一般认为1973年是基因工程诞生的元年上世纪40年代——70年代初分子生物学领域理论上的三大发现和技术上的三大发明对于基因工程的诞生起到了决定性的作用。第一节基因工程的诞生1944年，AveryO.T.利用肺炎双球菌转化实验1、DNA是遗传物质被证实40年代，证实DNA是遗传物质早在上世纪20年代，已经知道染色体由DNA和组蛋白构成，但组成蛋白的氨基酸有20种，而组成DNA的核苷酸只有4种，什么是遗传物质？1928年，英国微生物学家F.Griffith著名的肺炎双球菌感染小白鼠实验。（1）S型：注射小白鼠，死亡。（2）S型，65℃加热：注射小白鼠，活。（3）R型：注射小白鼠，活。（4）65℃加热S型+R型：注射小白鼠，死亡。死鼠体内得到了S型菌。40年代，DNA是遗传物质被证实1944年，美国洛克菲勒研究所的OswaldAvery等公开发表了改进的肺炎双球菌实验结果。（1）S型菌无细胞提取物及其纯化的DNA都可使R型菌转变成S型菌；（2）经DNase处理的S型菌无细胞提取物失去了转化作用。（3）经胰蛋白酶处理的S型菌无细胞提取物仍有转化作用。不仅证实了DNA是遗传物质，而且证明了DNA可以将一个细菌的性状转给另一个细菌，他的工作被称为是现代生物科学的革命性开端。Watson和Crick2、DNA双螺旋模型的提出50年代，DNA的双螺旋模型的提出和DNA复制机理的阐明DNA是遗传物质已被证实，但是DNA是怎样携带并传递遗传信息的？在细胞增殖过程中，DNA是怎样复制的？因此，对于DNA结构的研究成为了当时生物学家研究的热点。1953年，FrancisCrick和JamesWatson搜集了力所能及的资料，提出了DNA的双螺旋模型。随后，DNA的半保留复制和半不连续复制机理也被阐明，为基因工程的诞生奠定了坚实的理论基础。分子遗传学的诞生Nireberg等为代表的一批科学家3、“中心法则”的提出60年代，确定了遗传信息的传递方式（中心法则）既然，DNA是遗传信息的载体，那么它是如何传递遗传信息的呢？遗传信息又是如何控制生物的表型性状的呢？以Nireberg等为代表的一批科学家经过艰苦的努力，确定了遗传信息以密码方式传递，每三个核苷酸组成一个密码子，代表一个氨基酸，到1966年，全部破译了64个密码子，并提出了遗传信息传递的“中心法则”。原核生物的基因调控操纵子模型1961年，JacquesMonod和FancoisJacob提出了原核基因调控的操纵子模型（operonmodel）。一般认为1973年是基因工程诞生的元年上世纪40年代——70年代初分子生物学领域理论上的三大发现和技术上的三大发明对于基因工程的诞生起到了决定性的作用。第一节基因工程的诞生Smith等分离并纯化了限制性核酸内切酶HindII，1972年，Boyer等相继发现了ＥcoRI一类重要的限制性内切酶。1、工具酶的发现和应用1967年，世界上又五个实验室几乎同时发现DNA连接酶，特别是1970年Khorana等发现的T4DNA连接酶具有更高的连接活性。1、工具酶的发现和应用1970年，Baltimore等和Temin等各自发现了反转录酶，完善了中心法则，使真核基因的制备成为了可能。2、反转录酶的发现和应用1972年，美国Stanford大学的P.Berg等首次成功地实现了DNA的体外重组；3、载体的发现及其应用1973年，Stanford大学的Cohen等成功地利用体外重组实现了细菌间性状的转移。这一年被定为基因工程诞生的元年。3、载体的发现及其应用Cohen等的重组实验示意图TcrNerEcoRIEcoRI连接酶TcrNer双抗重组菌落基因工程发展史上首次实现了重组DNA的细菌转化第一节基因工程的诞生一般认为，1973年是基因工程诞生的元年。上世纪40年代——70年代初分子生物学领域理论上的三大发现和技术上的三大发明对于基因工程的诞生起到了决定性的作用。第一章导论第一节基因工程的诞生第二节基因工程的研究内容第三节基因工程的成就和前景展望生物工程biologicalengineering遗传工程geneticengineering基因工程geneengineering分子克隆molecularcloning基因克隆genecloning基因操作genemanipulation重组DNA技术recombinantDNAtechnique克隆（clone）有性杂交诱变育种体细胞融合酶工程农业工程发酵工程细胞工程与基因工程相关的几个概念什么是克隆（Clone）作为名词使用时，是指某一个体（或细胞、分子等）通过无性繁殖的方式产生的具有相同遗传背景的后代（或子细胞、分子等）组成的集体（或群体）；作为动词使用时，指产生上述集体或群体的工程。所以，植物的无性繁殖（如马铃薯的生产）、细菌的无性繁殖以及重组DNA分子通过工程菌的繁殖等过程都是一个克隆的过程。那么，克隆动物是怎么回事呢？基因工程的概念一般来说，基因工程是在体外将目的DNA（来源可以是动植物和微生物）和某一载体（DNA）系统进行重组，再将重组的DNA导入宿主细胞内，最后实现目的基因稳定复制和表达的过程。基因工程研究的基本步骤1、从生物体中分离得到目的基因（或DNA片段）2、在体外，将目的基因插入能自我复制的载体中得到重组DNA分子。3、将重组DNA分子导入受体细胞中，并进行繁殖。4、选择得到含有重组DNA分子的细胞克隆，并进行大量繁殖，从而使得目的基因得到扩增。5、进一步对获得的目的基因进行研究和利用。比如，序列分析、表达载体构建、原核表达以及转基因研究和利用等。基因工程的基本流程基因分离酶切载体酶切基因和载体连接导入细菌重组质粒繁殖重组克隆的选择序列分析和基因表达等研究导入植物细胞基因工程研究的主要内容基因工程研究的主要内容基础研究:basicresearch克隆载体研究:cloningvector受体系统的研究:hostcellsystem目的基因的研究:targetgene生物基因组学的研究:genomicresearch应用研究:application第一章导论第一节基因工程的诞生第二节基因工程的研究内容第三节基因工程的成就和前景展望基因工程的兴起1977年，激素抑制素的发酵生产成功。Itakara等，化学合成的激素抑制素基因和大肠杆菌-半乳糖（苷）激酶基因插入到PBR322中得到重组质粒，并通过大肠杆菌生产出含有激素抑制素的嵌合型蛋白，经溴化氰处理后释放出了有生物活性的激素抑制素。首次实现了真核基因的原核表达。用价值几美元的9升培养液生产出50毫克的生物活性物质，这相当于50万头羊脑的提取量。1978年，Goeddel等，人胰岛素的发酵生产成功。1979年，Goeddel等，又在大肠杆菌中成功表达了人生长激素基因。1980年，Nagata等，遗传工程菌生产干扰素获得成功。1981年，用遗传工程菌生产的生物制剂包括动物口蹄疫疫苗、乙型肝炎病毒表面抗原及核心抗原、牛生长激素等。1982年，重组DNA技术生产的药物-人胰岛素进入商品化生产。1983年，基因工程生产狂犬病疫苗取得突破型进展。作者受体动物猪器官基因构件数量移植体存活McCurry/1995狒狒心脏hDAF+hCD5934,11,30Norin/1996狒狒肺hCD59?12hrWhite/1995猕猴心脏（新生）hDAF85d(平均)Cozzi/1995猕猴心脏（新生）hDAF85d(平均)Cozzi/1997猕猴心脏（新生）hDAF107wkKroshus/1997狒狒心脏（正常）hCD59410d狒狒心脏hDAF32,13,21dWaterworth/1997狒狒心脏hDAF35,5,9dLin/1997狒狒心脏hCD59/hDAF529dDagger/1997狒狒肺hCD59/hDAF724hrBhaatti/1997狒狒心脏hDAF109dLawson/1997狒狒肾hCD59/hDAF610d狒狒心脏hCD55+hCD59+hCD461015dDiamond/1997狒狒肾hCD55+hCD59+hCD46715dDaggett/1997狒狒肺hMCP(Hcd46)312hr(平均)Yeatman/1998狒狒肺hCD59+hDAF43hrZaidi/1998猕猴肾hDAF735d利用转基因猪器官进行猪→灵长类异种移植1997年，动物基因工程产品销售额约1.8亿$转基因小鼠人类秃顶NatureBiotechnology,1999,17(1):9转基因家蚕防弹衣NatureBiotechnology,1999,17（5）：412‘83‘84‘85‘86‘87‘88‘89‘90‘91‘92‘93‘94‘95‘96‘97‘98‘99‘00‘01‘02FirsttransgenicplantDelay-ripeningtomatoCommercializedintheUSFirstfieldtestsHerbicideresistant,insectresistantplantscommercializedGMmaizeapprovedbyEUFirstBtcornplantsRottingresistanttomatoapprovedbyFDA植物基因工程的发展迅速ApartfromSomeMinorEffects,ThingsAreLookingVeryPromising!制造带有抗生素抗性基因或有产生病毒能力的基因的新型微生物有可能在人类或其它生物体内传播。1.对环境的影响2.新型病毒的出现重新组合一种在自然见尚未发现的的生物性状有可能给现有的生态环境带来不良影响。一、基因工程的安全隐患基因工程的安全性将肿瘤病毒或其它动物病毒的DNA引入细菌有可能扩大癌症的发生范围。4.人造生物扩散新组成的重组DNA生物体的意外扩散可能会出现不同程度的潜在危险。3.癌症扩散1.公众的担忧二、重组DNA研究的安全准则1973年美国的公众第一次公开表示担心应用重组DNA技术可能会培养出具有潜在危险性的新型微生物，从而给人类带来难以预料的后果。1974年美国国立卫生研究院（NIH）考虑到重组DNA的潜在危险，提请PaulBerg博士组成一个重组DNA咨询委员会。这个由11名分子生物学和重组DNA权威学者组成的委员会在同年7月发表公开信（science,158,303)，要求在没有弄清楚重组DNA所涉及的危险性范围和程度，以及在采取必要的防护措施之前，暂停两类试验（带抗生素抗性和肿瘤病毒及动物病毒）。2.专家的态度3.制定安全规则1976年6月