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Biacore基础课程乊一表面等离子共振(SPR)技术与Biacore原理通用电气公司生命科学部任薇薇13880720962/8008109118Weiwei.ren@ge.com课程目标•Biacore技术原理–表面等离子共振(SurfacePlasmonResonance,SPR)–传感图–Biacore提供的分子相互作用的信息•Biacore设备核心组件–SPR检测器–微流控系统(IFC)–传感芯片•Biacore分析的基本流程–固定–进样–再生BiacoreTMT200Biacore技术原理January20123Biacore实时监控分子相互结合、解离的过程结合解离Biacore:实时、无标记、活性分子互作分析棱镜入射光源反射光能量检测器微流路液相系统样品角度能量SPR角度时间50nm金膜表面等离子共振原理(SPR)表面等离子共振原理(SPR)•SPR是一种折光率传感器,其响应值反映了SPR角度的改变•响应信号依赖于芯片表面分子的浓度和温度•1RU的响应值大致上相当于芯片表面结合物质的浓度改变了1pg/mm2(蛋白结合与CM5芯片)表面等离子共振原理(SPR)10传感图(TheSensorgram)基线(Baseline)结合(Association)稳态/平衡(Steady-state/Equilibrium)解离(Dissociation)基线(Baseline)再生(Regeneration)反复上样响应单位:RU亲和力,浓度动力学,亲和力Biacore提供的生物分子相互作用信息:•有无结合(YesorNo)•结合的特异性和选择性(Specificity)•两种分子的结合强度--亲和力(Affinity)•结合和解离的快慢和复合体的稳定性--动力学(Kinetics)•功能复合体形成的参与者、协同者和组装顺序(Mechanism)•分子结合的温度与热力学特征(Thermodynamics)•目标分子活性含量的检测(Concentration)弱结合中等强度强结合mM10-3µM10-6nM10-9•亲和素-生物素结合:10−14M•强的抗原-抗体结合:10−8~10−10M•DNA与蛋白的结合:10−8~10−10M•较弱的抗原-抗体结合:10−6~10-7M•酶与底物结合:10−4~10−10M•蛋白与小分子结合:10−3~10−6M亲和力(Affinity,KD)不同的结合与解离速率反映了不同的作用机制,也决定了分子不同的功能与结构特征。较快动力学特征的药物:低剂量即可达到饱和,但需要多次给药较慢动力学特征的药物:需要高剂量来实现饱和,但药效持续时间久。相同的亲和力,不同的动力学,不同的功能解离速率慢结合/慢解离快结合/快解离等亲和力线结合速率研究RNA结合蛋白(HuD蛋白)上多个RNA识别结构域的功能RRM2与RRM3虽然对亲和力贡献不大,但却对RNA与HuD蛋白形成的复合体的稳定性有着重要的影响主要结合位点是RRM1在获取动力学分析结果之前,结构域2、3的功能一直为研究者所忽略动力学研究Biacore应用实例基因表达调控Biacore可研究的生物分子范围•蛋白质•DNA/RNA•脂类/脂质体/生物膜•多糖•多肽•小分子•全细胞/病毒/微生物CD4/gp120LMWcompoundmAbDetergent-solubilizedGPCRsnaturalchemokineAbcapturedonsensorsurfaceCD4/gp120LMWcompoundmAbDetergent-solubilizedGPCRsnaturalchemokineAbcapturedonsensorsurfaceBiacore™超过15000篇文献发表量Biacore应用领域包括:•肿瘤研究•神经科学•免疫科学•传染性疾病•功能蛋白质组•细胞信号传导与基因调控•疫苗开収•结合分子的筛选和表征•新药开収….….Biacore核心组件January201219Biacore核心组件SPR光学组件IFC微流路系统传感芯片微流控系统(IFC)微流控系统(IFC)•集成化、自动化的微流路控制系统•样品消耗量低•为互作分析而设计优化IFC流动池(放大图)微流控系统(IFC)–流动池•4个流动池–位于IFC上•可选择单独、配对、串联使用。•流动池为配对使用进行了优化(Fc1-Fc2,Fc3-Fc4)传感芯片葡聚糖基质连接层50nm金膜玻璃层羧基基团CM5芯片葡聚糖基质的重要性•亲水性,和2%浓度的葡聚糖水溶液环境相似•非特异性吸附极低•高结合容量•实现多种共价结合方式•出色的化学稳定性CM5传感芯片•羧基化的葡聚糖表面•最常用的传感芯片•出色的化学稳定性决定了可靠的实验重复性11种不同的芯片种类CM5,CM4,CM3:芯片蛋白、肽段、小分子等CM7:小分子化合物研究SA芯片:生物素标记的分子,如核酸、糖类等BiotinCAP芯片:可逆性生物素捕获芯片NTA芯片:His重组蛋白L1芯片:模拟脂质双分子层环境HPA芯片:实现膜系统相关的互作分析C1芯片:研究细胞、病毒等大颗粒分子Au裸金芯片:客户定制表面(材料、高分子等)30余种不同的试剂盒及缓冲液产品氨基偶联试剂盒、巯基偶联试剂盒;GST捕获试剂盒GST重组蛋白分析;NTA捕获试剂盒His重组蛋白分析;……传感芯片的选择Biacore分析的基本流程January201229分析物和配体的定义配体定义为“固定”于芯片表面的生物分子分析物Analyte配体Ligand分析物定义流动相中“流经”芯片表面的分子固定配体Biacore实验的基本流程样品进样再生数据分析固定配体Biacore实验的基本流程样品进样芯片再生固定配体Biacore实验的基本流程样品进样芯片再生数据分析固定配体Biacore实验的基本流程样品进样芯片再生数据分析固定配体Biacore实验的基本流程固定配体(Immobilization)–什么是固定配体?–将配体直接(共价)或者间接地(通过捕获分子)固定于芯片表面–直接固定(也称为“偶联”)–将配体共价偶联于芯片表面–捕获的方式–将捕获分子共价偶联于芯片表面–捕获分子在每个循环过程中通过亲合作用固定配体捕获分子Capturingmolecule样品进样(Injection)•分析物(Analyte)进样后,以恒定的流速和浓度流过芯片表面•样品中的待分析物与固定在芯片表面上的配体収生结合,芯片表面物质的质量収生改变,仪器记录下对应的响应值(response)的改变•进样结束后,切换缓冲液流过芯片表面,分析物由配体上自収解离,解离的进程由响应值实时监控。芯片再生(Regeneration)•将自収解离后仍然结合于配体的分析物彻底洗掉。•配体的结合活性必须保留课程小结实验设计方法灵活,用以检测多种分子和反应种类提供解释生物分子功能和结构的多项信息提供实时的,信息丰富的互作分析数据Biacore技术组成•SPR•传感芯片•微射流卡盘Biacore的主要分析步骤•固定(配体)•进样(分析物)•再生•数据分析Biacore提供的数据•特异性,亲和力,动力学,浓度
本文标题:1-Biacore-SPR原理介绍
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