色谱分离技术的演变和发展

附件3-5色谱分离技术的演变和发展（张卫[e-mail]）一、本探究实验需要讨论的问题：A组：(1)什么是色谱分离技术？它经历怎样的发展、演变过程？(2)简要说明色谱分析方法的基本原理，固定相和流动相的作用分别是什么？(3)柱色谱的色谱柱如何进行填充？填充过程中需要注意哪些问题？(4)简述柱色谱常用的洗脱剂及其洗脱能力的次序，如何选择合适的洗脱剂？采用柱色谱分离甲基橙和次甲基蓝混合染料时，为什么先用95%乙醇溶液作为洗脱剂，再用去离子水做洗脱剂进行洗脱，如果两者换一下次序是否可以？为什么？(5)设计实验：利用纸层析法进行植物色素的提取与分离任意采集叶片、果皮等有色植物适量，经过烘干、研磨、溶剂浸提、离心分离、点样、展开等操作，提取与分离植物色素。设计要求：通过文献查阅，判断所选的植物色素样本所含的色素种类有哪些？可以选取哪些合适的提取和分离色素的有机溶剂？如何分离各种不同的色素？设计相应的实验方法和步骤，给出所用的试剂及仪器。拟提供的试剂与仪器：石油醚、丙酮、乙醇、碳酸钙、烘箱、纸层析滤纸、表面皿、培养皿、研钵、离心机等；B组：(6)常用的色谱分析方法有哪些？分别有怎样的特点和适用范围？(7)薄层色谱中，最常用的固定相（吸附剂）有哪些？其颗粒的大小对于分离效果有何影响？影响固定相活性的主要因素有哪些？(8)薄层色谱的分离效果的评价指标是什么？如何进行计算？若化合物本身无色，薄层色谱的色谱图中组分迁移产生的展开斑点位置如何确定？试举例说明两种常用的确定方法。(9)采用薄层色谱分离顺式偶氮苯和反式偶氮苯的混合物时，若分别采用20:1环己烷-乙酸乙酯和10:1环己烷-乙酸乙酯作为展开剂，展开效果有何不同？为什么？(10)设计实验：利用纸层析法进行植物色素的提取与分离任意采集叶片、果皮等有色植物适量，经过烘干、研磨、溶剂浸提、离心分离、点样、展开等操作，提取与分离植物色素。设计要求：通过文献查阅，判断所选的植物色素样本所含的色素种类有哪些？可以选取哪些合适的提取和分离色素的有机溶剂？如何分离各种不同的色素？设计相应的实验方法和步骤，给出所用的试剂及仪器。拟提供的试剂与仪器：石油醚、丙酮、乙醇、碳酸钙、烘箱、纸层析滤纸、表面皿、培养皿、研钵、离心机等；二、实验设计文本示例：层析技术用于分离有机染料（一）实验目的学习色谱法分离和鉴定化合物的原理和基本操作，了解和掌握薄层吸附色谱展开剂、柱色谱中洗脱剂、植物色素的提取和分离试剂的选择原则。（二）实验原理层析分离是利用混合物的各组份随着流动的液体或气体（称流动相）通过另一种固定不动的固体或液体（称固定相）时，在两相中分配（选择性溶解）、吸附或其他亲和性能的差别，达到分离的目的。1、顺式偶氮苯与反式偶氮苯的分离偶氮苯在通常情况下采取反式结构，紫外光照下发生异构化，形成一部分顺式结构。由于顺式偶氮苯的极性比反式偶氮苯稍大，可利用薄层色谱将二者分离。反式偶氮苯顺式偶氮苯二者极性不同，采用合适的展开剂加以分离。并比较不同的展开剂（如20:1和10:1环己烷-乙酸乙酯混合溶液）Rf值的差别及原因。2、有机染料甲基橙和亚甲基蓝的分离有机染料甲基橙和亚甲基蓝的结构式如下：NNSO3NaNH3CH3C甲基橙NCl-SNN亚甲基蓝甲基橙的分子极性大于次甲基蓝，利用二者极性差异，将两种洗脱剂先后加入色谱柱，分离不同的染料。（三）实验仪器与试剂仪器：薄层板，锥形瓶，50ml烧杯，毛细管，层析缸，色谱柱，脱脂棉花等；试剂：光照过和未光照过的偶氮苯-苯溶液，硅胶G，0.5％羧甲基纤维素钠（CMC）水溶液，20:1和10:1环己烷-乙酸乙酯混合溶液展开剂，甲基橙和次甲基蓝混合溶液，中性Al2O3，95％乙醇，去离子水，石油醚、丙酮等；（四）实验步骤1．顺式和反式偶氮苯的分离（1）点样取2块薄层板，分别在距一端1cm处用铅笔轻轻划一横线作为起始线。取管口平整的毛细管插入样品溶液中，在板的起点线上点1％的未光照的偶氮苯的苯溶液和光照过的偶氮苯的苯溶液两个样点，样点间相距1～1.5cm。如果样点的颜色较浅，可重复点样，重复点样前必须待前次样点干燥后进行。样点直径不应超过2mm。（2）展开用20:1及10:1的环己烷-乙酸乙酯混合溶液为展开剂，待样点干燥后，小心放入已加入展开剂的250ml层析缸中进行展开，点样一端应浸入展开剂0.5cm。盖好盖子，观察展开剂前沿上升至离板的上端1cm时取出，尽快用铅笔在展开剂上升的前沿处划一记号，晾干后观察分离的情况，比较二者Rfƒ值的大小以及不同展开剂时Rfƒ值的大小。2.柱层析分离甲基橙与次甲基蓝混合染料(1)将内径约1.5cm的色谱柱洗净后在底部放入一小团脱脂棉花，加5ml95％乙醇溶液除气泡。(2)称量7g中性Al2O3放入小烧杯中，并用10ml95％乙醇调匀。(3)打开色谱柱活塞，控制乙醇流速为1滴/s，将Al2O3从柱顶一次加入柱内，并用装有橡皮塞的玻棒轻轻敲击管外壁，使其填装均匀。(4)待Al2O3全部下沉，通过转动轻敲使Al2O3柱顶成均匀平面，然后在表面轻轻地覆盖一张圆形滤纸。(5)当乙醇液面降至滤纸表面时，关闭活塞，用滴管沿管壁加入1ml次甲基蓝与甲基橙（1:1）的乙醇混合液。(6)打开活塞，仍控制流速为1滴/s，当混合液降至滤纸面时再关闭活塞，用滴管沿管壁滴入1～2ml95％乙醇，洗去粘附在柱壁上的液滴，打开活塞，让洗涤液降至滤纸面时，再加入3ml95％乙醇。(7)在色谱柱顶上装上滴液漏斗，用95％乙醇淋洗，洗脱速度1滴/s，观察色层带的形成和分离。(8)当蓝色次甲基蓝色带到达柱底时，更换接受器，收集全部此色带，然后改用水为洗脱剂，同时更换接受器。(9)当黄色甲基橙色带到达柱底时，再更换接受器，收集全部色层带。(10)色谱分离结束后，开活塞将柱内氧化铝倒入废物桶内，切勿倒入水槽。(11)回收次甲基蓝乙醇溶液和甲基橙水溶液。3.纸层析分离植物色素（自行设计）（五）实验数据记录（自行设计实验记录表）（六）实验结论