3第3章免疫原和抗血清的制备多媒体

第三章免疫原和抗血清的制备第一节免疫原的制备一、颗粒性抗原的制备二、可溶性抗原的制备和纯化三、半抗原性免疫原的制备第二节免疫佐剂一、佐剂的种类二、佐剂的作用机制第三节抗血清的制备一、免疫动物的选择二、免疫程序三、动物采血法第四节抗血清的鉴定和保存一、抗血清的鉴定二、抗血清的保存第五节抗血清的纯化一、特异性IgG抗体二、单价特异性抗血清思考题小结•基本要求：•掌握：免疫原、抗血清的制备过程。•掌握：抗血清的鉴定方法、抗血清的纯化方法第一节免疫原的制备免疫原(immunogen)是能诱导机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能在体内外与抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。颗粒性抗原－细胞、细菌、寄生虫可溶性抗原－蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核酸细胞抗原：绵羊红细胞细菌抗原：菌体抗原、鞭毛抗原寄生虫体抗原：虫卵一、颗粒性抗原的制备颗粒性抗原的制备颗粒性抗原包括人和各种动物细胞抗原以及各种细菌抗原和寄生虫体抗原。•细胞抗原：（绵羊红细胞）一般情况下经生理盐水洗净，配制一定浓度的细胞悬液，即可应用。免疫原的制备•细菌抗原多用液体或固体培养物，经集菌后处理。•鞭毛抗原需用0．3%~0．5%的甲醛处理；菌体抗原加温100℃2~2．5h去除鞭毛抗原；毒素抗原则在杀菌后再加0．5%~1．0%氯化钙溶液等。•颗粒抗原大多用静脉内注射免疫法，较少加佐剂作皮内注射。•蛋白质、糖蛋白、细菌毒素、酶、补体和核酸都是良好的可溶性抗原。•这些蛋白质多为复杂的蛋白组成，免疫前需进行纯化。二、可溶性抗原的制备和纯化组织细胞抗原的制备：高速捣碎法－组织捣碎机捣碎研磨法－用玻璃匀浆器或乳钵研磨（一）二、可溶性抗原的制备和纯化•高速组织捣碎机法：•将组织加盐水装入捣碎机筒内，间断进行离心，每次30到60分钟，时间过长会导致产热。•研磨法：•用玻璃均浆器或乳钵研磨，经过旋转、压挤将组织粉碎。•组织均浆液要离心沉淀，沉淀物组织和细胞碎片，上清液为提取可溶性抗原的材料。二、可溶性抗原的制备和纯化•组织细胞或培养细胞可溶性抗原的制备•制备抗原的细胞包括正常的细胞、传代细胞或肿瘤细胞。•细胞抗原一般分为三个部分：膜蛋白抗原、细胞质抗原（细胞器）和细胞核与核膜抗原。二、可溶性抗原的制备和纯化组织细胞或培养细胞可溶性抗原的制备：反复冻融法－-20℃冻结，然后室温融化超声破碎法－超声波（1～20kHz）自溶法－自身酶系酶处理法－溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶表面活性剂处理法－SDS、去氧胆酸钠、二乙基十六烷基溴•反复冷冻法：将细胞或整块组织置-20℃冰箱内冻结，然后置室温融化，如此反复两次，大部分组织细胞及细胞内的颗粒可冻融破碎。•超声破碎法：利用超声波机械振动的原理使细胞破碎。常用于处理微生物和组织的细胞。自溶法：利用组织和微生物的自身酶系统，在一定PH和温度下，使其细胞裂解。•酶处理法：溶菌酶、蜗牛酶、纤维素酶等，在一定的条件下能消化细菌和组织细胞。•表面活性剂处理法：常用十二烷基硫酸钠等表面活性剂处理。超速离心法：差速离心法－低速和高速离心交替进行密度梯度离心法－区带离心法（二）可溶性抗原的纯化超速离心分离法•常用于分离亚细胞成分及大分子蛋白。•差速离心法：用于分离大小差异较大的抗原颗粒•梯度密度离心法：区带分离法，通过梯度密度离心，使各类分子量的颗粒分离。（梯度柱）。选择性沉淀法：核酸去除法－氯化锰、硫酸鱼精蛋白、链霉素盐析法－硫酸铵、硫酸钠有机溶剂沉淀法－乙醇、丙酮聚合物沉淀法－聚乙二醇选择沉淀法•采用各种沉淀剂或某些条件促使抗原成分沉淀的方法。•核酸去除法：可采用氯化锰、硫酸鱼精蛋白等核酸提取沉淀剂，而核糖核酸降解法更简单（采用DNA或RNA酶）•有机溶剂沉淀法：使用的有机溶剂多为乙醇或丙酮。选择沉淀法•盐析沉淀法经典的蛋白质纯化分离技术抗原的初筛：用不同饱和度的硫酸钠或硫酸铵使蛋白抗原进行初筛。•提取丙种球蛋白:（IgG95%以上）将33%~50%饱和度硫酸胺沉淀物经去盐后可直接用于抗体试剂。•抗原的浓缩：通过加入硫酸铵，将其沉淀下来，以利于进一步纯化。离子交换层析法：利用蛋白质带电荷不同进行分离离子交换剂：离子交换纤维素、离子交换凝胶、离子交换树脂凝胶过滤法：利用凝胶的分子筛作用，对分子量不同的蛋白质进行分离凝胶过滤•分子筛层析，具有三维空间多孔网状结构的物质。•将含多种分子量的样品溶液缓慢流经凝胶柱时，各分子在柱内进行两种不同运动，垂直向下移动和无定向扩散运动。•通过凝胶分子筛作用，大、中、小三类分子彼此较易分开。离子交换层析•离子交换层析是利用一些带电离子集团的凝胶或纤维素，吸附带有相反电荷的蛋白质抗原。•1、具有离子交换集团的纤维素。•2、具有离子交换集团的交联葡萄糖、琼脂糖和聚丙烯酰胺。•3、被覆以离子化物质的细粉。•4、凝胶合成的高度交联树脂。亲和层析•是利用生物大分子的生物学特异性，即生物分子间具有的专一性亲和力的层析技术。•在一定条件下，二者能紧密结合成复合物，如将复合物的已知一方固定在固相载体上，则可从溶液中专一性地分离和提纯另一方。亲和层析法：利用生物大分子之间具有的专一性亲和力(1)亲和层析支持物的选择：①非特异性吸附低；②液体流速快；③在各种pH和高浓度盐溶液中稳定；④有合适丰富的化学基团，与蛋白质或其它化合物结合；⑤有丰富的微孔，以增加结合容量。最常用的支持物是Separose4B（琼脂糖珠）(2)配体的选择条件：①抗原或抗体必须单一特异性；②抗原与抗体必须具有较高的亲和力；③配体必须有一个适当的化学基团。亲和层析•抗原或抗体与支持物的结合•将抗原或抗体结合到支持物上的方法达数十种，可归纳为载体结合法、物理吸附法、交联法和网络法。•结合法的步骤是先活化支持物上的功能集团，抗原抗体连接到这些活化的集团上。(4)亲和层析条件的选择：①封闭活性基团：用无关蛋白质或三乙醇胺过柱；②除去未结合和结合不牢的蛋白：先用NaHCO3洗脱，再用解脱剂处理；解脱剂：3mol/L硫氰酸钾（或钠）、0.1mol/LpH2.4甘氨酸缓冲液•制备菌体抗原的方法是•A100℃加温2小时B0.5%甲醛•C75%乙醇D1%氯化钙•E2％氯仿•分离亚细胞成分最常用的方法是•A凝胶过滤法B低速离心法•C超速离心法D选择性沉淀法•E高速离心法•配制绵羊红细胞免疫原一般细胞浓度为•A103∕mlB104∕ml•C105∕mlD106∕ml•E107∕ml•颗粒性抗原免疫接种的方法通常采用•A皮下注射B淋巴结注射•C肌肉注射D皮内注射•E静脉注射免疫球蛋白片段的制备•免疫球蛋白具有抗体活性，五类免疫球蛋白都能用纯化的方法提取出来。•将其分解成片段，如Fab段、Fc段和轻链等作为免疫原制备抗血清，能制得分辨能力更高的特异性抗体，制备方法如下：免疫球蛋白片段的制备：非共价键解离法－改变pH、利用强变性剂共价键解离法－氧化法和还原法溴化氰裂解法酶解法－木瓜酶、胃蛋白酶酶裂解法•酶对免疫球蛋白的水解有极好的专一性。•如木瓜蛋白酶可将IgG裂解成一个Fc和两个Fab片段；胃蛋白酶可将水解成F（ab’）2和数个小片段；胰蛋白酶将IgG切成不规则肽链。•用木瓜酶水解得到的Fc段作为抗原制备重链血清，胃蛋白酶水解抗体试剂用。（三）纯化抗原的鉴定蛋白含量测定：紫外吸收法、双缩脲法、酚试剂法分子量测定：SDS-PAGE、凝胶过滤纯度鉴定：醋酸纤维膜电泳、SDS-PAGE、毛细管电泳、等电聚焦、高效液相层析免疫活性鉴定：双向免疫扩散、免疫电泳、ELISA•制备人工抗原时，最常用于偶联半抗原的载体是•A牛血清白蛋白B牛甲状腺球球蛋白•C人血清白蛋白D人甲状腺球蛋白•E兔血清白蛋白第二节免疫佐剂免疫佐剂：那些与抗原一起或先于抗原注入机体后，可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答的类型的物质称为免疫佐剂,简称佐剂.非免疫原性的佐剂:氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钙、石蜡油、羊毛脂、表面活性剂、藻酸钙、人工合成的多聚肌苷酸和胞壁肽。具有免疫原性的佐剂:如卡介苗、枯草分支杆菌、短小棒状杆菌、百日咳杆菌、革兰氏阴性杆菌内毒素（脂多糖）和细胞因子。用于人体的佐剂：氢氧化铝、明矾、polyI∶C、胞壁酰二肽、细胞因子、热休克蛋白常用于动物实验的佐剂：弗氏佐剂(Freund’sadjuvant)一、佐剂的种类弗氏佐剂(Freund,sadjuvant)：弗氏完全佐剂－羊毛脂与液体石蜡的混合物弗氏不完全佐剂－弗氏完全佐剂加卡介苗乳化方法：研磨法和搅拌混合法•细胞因子佐剂与抗原合用，可以更有效激发机体免疫功能，增强免疫反应。•白细胞介素2（IL－2）、IL－1、干扰素、粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（CSF，GM－CSF）具有佐剂作用。•抗寄生虫或肿瘤疫苗研究应用中，在细胞因子佐剂辅助下，刺激机体产生具保护作用的细胞免疫。一、佐剂的种类•1、增强免疫原性使弱免疫原性物质变成持久或强的免疫原。•2、增加抗体的滴度提高机体初次和再次免疫应答的抗体滴度。•3、引起或增强迟发性超敏反应由于佐剂作用引起过强的免疫应答导致病理生理反应。二、佐剂的免疫生物学作用改变抗原物理性状，延缓其降解和排除，更有效刺激免疫系统。刺激单核-吞噬细胞系统，增强其处理和提呈抗原的能力。刺激淋巴细胞增殖和分化。三、佐剂的作用机制第三节抗血清的制备抗血清的制备是将制备好的免疫原按照一定的免疫程序接种给所选择的动物，该动物在含有多种抗原表位的抗原刺激下，体内多个B细胞克隆被激活并产生针对某一抗原多种不同表位的抗体，其混合物为多克隆抗体多克隆抗体的产生示意图多克隆抗体(polyclonalantibody,pcAb)：天然抗原刺激多种B淋巴细胞克隆产生的多种抗体的混合物抗原来源与动物种属的关系种属差异越远，免疫原性越强动物个体的选择适龄、健康、体重符合要求抗原的性质IgE对绵羊，胰岛素对家兔免疫后不易出现抗体一、免疫动物的选择免疫原的剂量中间剂量范围内，免疫原剂量增加可获得高效价抗体免疫间隔时间第一次和第二次间隔10～20天，三次及以后间隔7～10天免疫途径皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结二、免疫方法和途径•抗体产生的阶段：•1、静止期（2天）血液中无抗体，仅有抗原。•2、指数期（4天）动物体内抗体水平上升，抗体含量6～7天达高峰•3、稳定期（2～4周）相对稳定水平•4、下降期（几个月至一到两年）二、免疫方法和途径颈动脉采血法：家兔、绵羊、山羊心脏采血法：家兔、豚鼠、大鼠、鸡静脉采血法：家兔、山羊、绵羊三、动物采血法第四节抗血清的鉴定和保存抗体特异性的鉴定：双向免疫扩散法抗体效价的鉴定：凝集试验、双向免疫扩散试验、ELISA抗体纯度的鉴定：SDS-PAGE、双向免疫扩散试验、免疫电泳抗体亲合力的鉴定：平衡透析法、ELISA、RIA竞争结合试验一、抗血清的鉴定•在琼脂平皿上打两排孔，一排放抗原粗提物和纯化抗原，另一排加抗血清，37℃温箱，进行双向扩散18～24h后，观察两排孔的沉淀线。•抗血清与粗抗原出现一条线，产生单价特异性抗体双向免疫扩散对抗体特异性鉴定双向免疫扩散法对抗体效价的鉴定•测定抗体效价有两种稀释方法：•1、稀释抗血清，倍比稀释，分别与一个浓度的纯抗原反应。•2、同时稀释抗原和抗血清，即将抗原作倍比稀释或按浓度稀释，分别与不同浓度抗血清进行双扩散试验。•鉴定纯化方法：SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）2℃～8℃保存：短期保存冰冻保存：保存5年真空干燥保存：保存5～10年二、抗血清的保存第五节抗血清的纯化抗原免疫动物制备的抗血清是成分复杂的混合物，除含有特异性抗体外，还存在与目的抗体不相关的成分。纯化目的是除去这些不相关成分，防止抗血清中其他杂抗体干扰试验结果。盐析法：硫酸铵盐析法、硫酸钠盐析法凝胶过滤法：常结合盐析法离子交换层析法：DEAE纤维素、QAE-sephadex、QAE纤维素亲和层析法：纯化抗原或SPA交联Sepharose4B制成亲和层析柱一、特异性IgG抗体单价特异性抗血清•血清只与其特异性抗原发生反应。•免疫原不纯，含有微量的杂抗原，制备出的抗血清出现2－3种杂抗体。•即使用纯抗原，用高度纯的IgG免疫动物，出现的抗体总会有抗r