熊果酸提取的研究工艺

熊果酸提取的研究工艺刘影练丽秋浙江万里学院生物与环境学院生物技术063指导教师：汪财生高级实验师熊果酸(Ursolciacdi)又名乌苏酸、乌索酸，属于有机三萜酸。熔点254-257摄氏度，是羟基酸，易溶于熊果酸溶于甲醇、乙醇、丁醇、丁酮、氯仿、丙酮等，不溶于水及石油醚。味苦，有一定的光学活性，比旋光度59（c=0.3，cyridine）作用：近来研究还发现熊果酸是很好的免疫增强剂,具有较强的免疫增强作用和抗致癌、抗促癌、诱导F9畸胎瘤细胞分化和抗血管生成、抗将血清软氨酶、抗糖尿病等作用,且毒性小。所以熊果酸有望成为低毒有效的新型抗癌药。另外还具有明显抗氧化功能，因而医药和化妆品原料、食品的乳化剂，具有抗糖尿病作用。熊果酸在药用植物中分布广泛,尤以枇杷叶中含量较高。枇杷叶是传统的常用中药,具有止咳、清肺和胃、降气化痰之功效。研究表明,枇杷叶中含皂苷、苦杏仁苷、熊果酸、齐墩果酸、丁香素、枸橼酸盐、鞣质、维生素B1和维生素C等。通过提取、分离、纯化等步骤制得熊果酸,工艺简便易行,为熊果酸的工业化生产和综合利用枇杷叶资源提供了参考依据。1111仪器与试剂1.11.11.11.1仪器ES-C600天平(湘仪天平仪器厂);超声波振荡仪(上海Branson);RE-52旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);电热恒温水浴锅(北京医疗设备厂意成公司);TG16-Ⅱ台式离心机(长沙平凡仪器仪表有限公司);高效液相色谱仪(液相色谱仪用HPagilent1100,检测器用紫外可见检测器,SEPU色谱工作站3000)。1.21.21.21.2试剂95%乙醇(武汉宏大化学试剂厂生产,分析纯,符合GB679-94标准);甲醇(天津市科密欧化学试剂开发中心提供,色谱纯);石油醚(60~90℃,天津市科密欧化学试剂开发中心提供);活性炭;熊果酸、齐敦果酸(中国药品生物制品检定所);枇杷叶,干燥,粉碎备用;水为蒸馏水、离子水。2222提取与纯化方法2.12.12.12.1提取称取枇杷叶粉末[过20目筛,100g置于烧杯中,用8倍量95%乙醇超声提取3次,每次30min。合并3次提取液,过滤除去残渣,减压回收乙醇,得浸膏。20目筛趁热过滤石油醚24h浸提枇杷叶、粉碎、烘干乙醇回流提取溶剂浓缩得浸膏NaOH溶液水洗无水乙醇活性炭热乙醇结晶洗出液（无色)溶解过滤放冷静置白色片状加热回流脱色反复洗残渣热乙醇重结晶熊果酸粗品高效液相溶解2.22.22.22.2纯化将浸膏依次用石油醚、1%氢氧化钠水溶液、水洗至洗出液近无色,烘干。再用无水乙醇加热溶解,加活性炭回流脱色20min,滤过。用热乙醇反复洗涤残渣,合并滤液及洗液,蒸去部分乙醇,放冷,静置,得白色片状结晶;过滤,滤饼加入乙醇,加热煮沸,趁热过滤,滤渣反复用乙醇重结晶得白色针状结晶。图1.提取熊果酸的原则工艺流程2.2.12.2.12.2.12.2.1大孔吸附树脂层析法大孔吸附树脂是一类不含离子交换基团的交联聚合物，理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂，对有机物有浓缩、分离作用且不受无机盐及离子、低分子化合物的干扰。它的吸附作用通过表面吸附、表面电性或形成氢键而完成。大孔吸附树脂与有机物的作用力主要为范德华引力与氢键。首次采用大孔吸附树脂富集柱和大孔吸附树脂纯化柱串联的方法分离纯化熊果酸。富集柱优先吸附熊果酸以除去大量杂质，使熊果酸的纯度从28.05%提高到85.0%以上，再用纯化柱除去熊果酸中的部分杂质，使熊果酸的纯度进一步提高到95.0%以上。分步洗脱富集柱时发现，50%以下的乙醇溶液可以有效除去杂质，而熊果酸则可用pH为10的80%乙醇溶液解吸，解吸率为98.0%以上。在pH为10的80%乙醇溶液中，纯化柱对杂质的吸附率为98.76%，而对熊果酸的吸附率仅为0.05%。洗脱剂组合，即水一20%乙醇一50%乙醇一52%乙醇一80%乙醇(pH=10)，每一段洗脱剂的体积分别为:50，50，150，100，100ml。将富集柱熊果酸的解吸过程与纯化柱杂质的吸附过程串联即可达到纯化熊果酸的目的。富集柱和纯化柱再生容易，经过再生后，树脂的吸附率均可恢复到98%以上;大孔吸附树脂技术以其独特的优势广泛用于中草药化学成分的分离纯化，主要用于水溶性物质的分离，如水溶性生物碱、黄酮类化合物、昔类化合物、皂昔类化合物、多酚类或酸性化合物、糖类、维生素、色素等。2.32.32.32.3高效液相色谱法高效液相色谱用于熊果酸分离测定具有快速、高效、操作方便等优点。用于熊果酸分析的高效液相色谱柱的固定相为C18，即十八烷基键合相硅胶，流动向以甲醇一水体系为主。甲醇与水的比例变化较大，从80:20~97:3不等。采用甲醇一磷酸盐缓冲液为流动相，熊果酸进样量在0.251一10.0409呈良好的线性关系，最小检出限(信噪比)3)为0.1509(HP一1050DAD检测器)。HPLC法检测器大多使用紫外检测器，检测波长在210~220nm之间。熊果酸甲醇溶液紫外吸收的最大波长为204nm，但甲醇在此波长下亦有很强的背景吸收，为减少干扰，一般选择215lun~220nln作为熊果酸的检测波长。HPLC法测定熊果酸的含量已经得到长足的发展，采用调节流动相的pH值和加入盐等手段以改善色谱峰峰形和分离度，提高检测灵敏度和准确度。总之，HPLC法用于熊果酸测定具有快速、高效和操作方便等优点，因此，本研究选用HPLC法作为分析检测手段。①色谱条件:色谱条件:Hypersi1C:，色谱柱(250nunx4.6mm，10腼);流动相:甲醇一水一磷酸二氢钠一二乙胺(88:12:0.20:0.02(v/v));流动相用微滤膜过滤后，超声脱气处理20min;检测波长入=220nm;流速0.5ml/min;柱温为25℃，检测灵敏度为0.04。②对照品标准样品溶液的配制:精密称取熊果酸对照品用甲醇配制成浓度为1mg·mL-1的对照品溶液，摇匀，再做梯度稀释为20μg·mL-1、50μg·mL-1、100μg·mL-1，125μg·mL-1的熊果酸标准样品。一进样量为横坐标、峰面积为纵坐标，电脑绘制标准曲线，其回归方程：Y=19.22652X-18.19440,R=0.99904.③提取溶液的配制:精密称取0.229g结晶Ⅰ,甲醇溶解并定容至25mL,得供试品1。精密量取供试品1及对照品溶液混合。④高效液相分析:分别精密量取对照品溶液、供试品1,在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析,在保留时间为17.292min处出现一单峰。用面积归一化法计算供试品1的峰面积为94.15%。3333讨论本实验除杂过程中,由于熊果酸不溶于水和石油醚,所以分别用水和石油醚去除水溶性和脂溶性杂质。以60~90℃的石油醚洗,先浸泡2min再抽滤,滤液弃去,滤渣继续同法洗数次直至滤液几近无色。通过实验,1%氢氧化钠水溶液可以洗去一些酸性物质但洗不去熊果酸。用水洗时,加水沉降12h后抽滤,同样洗至滤液近无色。比较没洗的和洗后的样品的高效液相图谱,洗过的样品明显杂质峰已去掉,只有甲醇的溶剂峰和齐墩果酸以及熊果酸的峰。在重结晶过程中,用活性炭水浴脱色,过滤后放置有白色片状物析出,滤出结晶滤液中仍有少量淡黄色的固体析出,但晶形不好,且高效液相色谱测定图谱显示后析出的这些固体中齐墩果酸的含量渐渐增高。所以用热甲醇重结晶时可以分离两种酸但损失产品。另外,加入的活性炭也会吸附产品,造成损失;提取过程中的转移除杂等步骤也会有损失。在本实验中测定的枇杷叶中熊果酸的含量为9.987mg·g-1,而最后提取得率只约有40%,约损失了60%,但由于绝对含量较高,所以以枇杷叶为原料提取熊果酸是可行的,更好的方法有待进一步研究。在对熊果酸方法进行了较系统的研究后建立的这套提取工艺是最简单而且最节省时间和根据理论来讲最切合实际的提取方案。在提取过程中还可以借助超声波辅助提取，随着科学技术的不断进步，现代高新提取技术有了快速发展，超声波辅助提取技术具有省时、节能、对有效成分损害小、提取率高等优点，在现代药物生产中备受关注。参考文献[1]陈武,熊筱娟,李开泉,等.乌索酸的化学、药理及临床研究[J].宜春医专学报,2001,13(2):123-126.[2]相延英,杨光.常用中药中齐墩果酸和熊果酸的含量测定[J].中国医院药学杂志,2004,24(5):316-318.[3]相延英,杨昕,杨光,等.枇杷叶中熊果酸的醇提工艺[J].医药导报,2005,24(2):144-145.[4]陈武,李开泉,熊筱娟.乌索酸的化学、药理及临床研究[J].中草药,2001,32(增):208-210.[5]李开泉,陈武,熊筱娟,等.乌索酸的化学、药理及临床应用进展[J].中成药,2002,24(9):709-711.[6]陈冲,孙来久.植物化工工艺学[M].西安:西北大学出版社,1996:243-253.[4]袁珂.微波加热快速测定中药提取物的干重及出膏率[J].河南科学,1998,16(1)∶108.[7]袁珂,刘延泽,冀春茹.中草药化学成分研究中几种不同提取方法的比较研究[J].天然产物研究与开发,1997,9(4)∶57.[8]季宇彬.中药有效成分药理与应用[M].黑龙江:黑龙江科学技术出版社,1995:481-483.[9]黄镜,孙燕.芦笋有效成分熊果酸诱导HL-60细胞凋亡的实验研究[J].中国中西医结合杂志,1999,19(5):296-296.[10]王杰军,王兵,郭静,等.熊果酸体外抑制血管形成的研究[J].第二军医大学学报,2002,21(11):1071-1071.