实验七--外源基因在大肠杆菌中的诱导表达

分子生物学实验Experimentsofmolecularbiology实验七外源基因在大肠杆菌中的诱导表达实验八外源基因在大肠杆菌中的诱导表达【目的要求】通过本实验了解外源基因在原核细胞中表达的特点和方法【实验原理】本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。表达蛋白可经SDS-PAGE检测。IPTG诱导原理：E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导。在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。•原核表达：将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。•大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。•大肠杆菌中表达体系的缺点：大肠杆菌表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。•典型的表达载体应具有以下几种元件：1、选择标志的编码序列；2、可控转录的启动子；3、转录调控序列(转录终止子、核糖体结合位点)；4、一个多限制酶切位点接头；5、宿主体内自主复制的序列。【实验器材】空气恒温振荡器，三角烧瓶，电泳仪，垂直电泳槽，微量移液器（20uL,200uL1000uL），EP管，凝胶成像系统等。【实验材料】重组大肠杆菌，IPTG（在800μl蒸馏水中溶解200mgIPTG后,用蒸馏水定容至1ml,用0.22μm滤膜过滤除菌，分装于eppendorf管并储于-20℃。），5x蛋白加样缓冲液、无菌水等。【实验内容】1．外源基因在大肠杆菌中的诱导表达2．最佳蛋白收获时间的确定等三、实验方案1.接入含AMP（50ng/mL）的50ml的LB培养基里，置入摇床中震荡培养，待OD600值达到0.8后，加入500μl的IPTG（24mg/mL）溶液，混匀后，先取出0.5ml菌液，标记为t0。再将菌液置入恒温摇床37℃震荡陪养，每隔半小时分别取出菌液0.5ml。本实验一共连续诱导大肠杆菌表达目的基因的蛋白2.5个小时。2.样品取出后均需13000转/分钟离心2分钟，去上清，菌体沉淀置于-20度冰箱，下节课待用。3.加入80ul的去离子水把菌体充分悬起后再加入20ul的5×SDS上样缓冲液混合，在100℃水浴5分钟，离心12000转/分钟，离心1min，取上清液，做好诱导时间标记。。大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化1细菌的裂解：常用方法有：①高温珠磨法；②高压匀浆；③超声破碎法；④酶溶法；⑤化学渗透等。前三种方法属机械破碎法，并且方法①、②已在工业生产中得到应用，后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。1、酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶；β-1,3-葡聚糖酶；β-1,6-葡聚糖酶；蛋白酶；壳多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用，而其他几种酶对酵母作用显著。主要步骤为：①4℃，5000rpm离心，15min，收集诱导表达的细菌培养液（100mL）。弃上清，约每克湿菌加3mL裂解缓冲液，悬浮沉淀。②每克菌加8μLPMSF及80μL溶菌酶，搅拌20min；边搅拌边每克菌加4mg脱氧胆酸（在冷室中进行）。③37℃，玻棒搅拌，溶液变得粘稠时加每克菌20μLDNaseI。室温放置至溶液不再粘稠。2、超声破碎法。声频为15-20kHz的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎，在处理少量样品时操作简便，液体量损失较少，同时还可对染色体DNA进行剪切，大大降低液体的粘稠度。①收集1L诱导表达的工程菌，40℃，5000rpm离心，15min；弃上清，约每克湿菌加3mLTE缓冲液。②按超声处理仪厂家提供的功能参数进行破菌；10000g离心，15min，分别收集上清液和沉淀。③分别取少量上清和沉淀，加入等体积的2×凝胶电泳加样缓冲液，进行SDS-PAGE。注意事项：超声破碎与声频、声能、处理时间、细胞浓度、菌种类型等因素有关，应根据具体情况掌握；超声波破菌前，标本经3-4次冻溶后更容易破碎。3、包涵体的分离蛋白质在细菌中的高水平表达，常形成相差显微镜下可见到的细胞质颗粒，即为包涵体，经离心沉淀后可用Triton-X100/EDTA或尿素洗涤，若为获取可溶性的活性蛋白，须将洗涤过的包涵体重新溶解并进行重折叠。（1）试剂与配制①洗涤液I：0.5%TritonX-100,10mmol/LEDTA(pH8.0)溶于细胞裂解液中。②2×凝胶电泳加样缓冲液。（2）细胞裂解混合物12000g离心，15min,4℃；弃上清，沉淀用9×洗涤液l悬浮；室温放置5min;12000g离心15min,4℃；吸出上清，用100μL水重新悬浮沉淀；分别取10μL上清和重新悬浮的沉淀，加10μL2×凝胶电泳加样缓冲液，进行SDS-PAGE。4、包涵体的溶解和复性（1）试剂与配制①缓冲液I：1mmol/LPMSF,8mol/L尿素,10mmol/LDTT溶于前述裂解缓冲液中。②缓冲液Ⅱ：50mmol/LKH2PO4,1mmol/LEDTA(pH8.0),50mmol/LNaCI2mmol/L还原型谷胱甘肽,1mmol/L氧化型谷胱甘肽③KOH和HCI。④2×凝胶电泳加样缓冲液。（2）用100μL缓冲液I溶解包涵体；室温放置lh；加9×缓冲液Ⅱ，室温放置30min，用KOH调pH到10.7；用HCI调至pH8.0，在室温放置至少30min;1000g离心，15min，室温；吸出上清液并保留，用100μL2×凝胶电泳加样缓冲液溶解沉淀；取10μL上清，加10μL2×凝胶电泳加样缓冲液，与20μL重新溶解的沉淀进行SDS-PAGE。四、注意事项（1）不同的大肠杆菌表达载体带有不同的启动子和诱导成分，实验者必须根据特定系统和用途决定相应的实验方案。（2）表达和检测时，应设置对照组，如转化载体和非诱导细胞。（3）由于大肠杆菌中表达的重组蛋白质缺少哺乳动物细胞特异的翻译后加工，所以，其生物活性无法与天然蛋白质相提并论。思考题：1、用IPTG诱导表达的时间是否越长越好？为什么？2、如果发现诱导后目标蛋白没有表达应该采取什么措施？